Ihr Weg zur Super-Sensitivität

Der Leica HyD

  • ist integriert in das Leica SP-Detektor-Modul für lückenlose, multi-spektrale Bildgebung,
  • benötigt eine geringere Lichtdosis durch höhere Sensitivität,
  • eignet sich perfekt für Hochgeschwindigkeitsaufnahmen,
  • ist quantitativ durch Einzelphotonzählung,
  • detektiert in der Descanned- und Non-Descanned-Position,
  • Bis zu vier HyDs sind gleichzeitig verwendbar durch das modulare Konzept des Leica TCS SP8,
  • NEU! Leica HyD SMD ist der universelle Detektor für FCS , FLIM und super-sensitive Bildaufnahmen.
Neuromuskuläre Verbindung bei Drosophila melanogaster, markiert mit Bruchpilot::mStrawberry. Der Hintergrund des PMT ist durch das Restrauschen, das in der Maximumsprojektion vervielfacht wird, unscharf, während das mit dem HyD aufgenommene Bild rauschfrei ist.

Wenig Dunkelrauschen – hoher Kontrast

Empfindliche Lebendproben müssen mit wenig Licht bei hoher Empfindlichkeit (Gain) des Detektors aufgenommen werden. Geringes Rauschen kann von entscheidendem Vorteil sein, wenn es um schwach gefärbte Strukturen geht. Niedriges Dunkelrauschen sorgt für maximale Signaleffizienz, besonders wenn Photonen akkumuliert werden um mehr Information zu erhalten. Andernfalls erhöht  sich das Hintergrundrauschen im Bild.

Der Leica HyD verfügt über ein überlegenes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, das ermöglicht, die feinsten Details einer Probe wiederzugeben – sogar bei heiklen Proben wie stark streuenden Gewebeschnitten.  Der Leica HyD reduziert das Dunkelrauschen, verbessert den Bildkontrast und liefert somit mehr Information. Die erhaltenen Bilder sind sofort publikationsreif − ohne weitere Bildbearbeitung.

Kontrastverbesserung des Leica HyD im Vergleich zum PMT.

Probe: Tubulin
Anregung: Argon laser 488 nm, 0,2% absolute Leistung
Imaging: 16x Akkumulation
Detektion: 500 - 620 nm
PMT Spannung: 800 V
HyD gain: 100%

Das Kontrastverhältnis ist als Quotient der mittleren Intensität in der dunkelsten (blau) und hellsten Region (grüner Kreis) dargestellt.

Kontrast von PMT vs. HyD
Drei- bis Vierzellstadium von Caenorhabditis elegans markiert mit EGFP-Tubulin.

Hochgeschwindigkeitsaufnahmen mit maximaler Wiedergabetreue

Entwicklungsprozesse zu beobachten, bedeutet, Bildserien über einen bestimmten Zeitraum aufzunehmen. Wenn man die Bildung von Strukturen räumlich und zeitlich auflösen möchte, erfordert dies das richtige Gleichgewicht zwischen Aufnahmegeschwindigkeig und Wiedergabetreue.

In Kombination mit dem Tandem Scanner bietet der Leica HyD eine nie zuvor erreichte  Bildqualität. Die resonante Scanfrequenz des Tandem Scanners (8 oder 12 kHz) lässt sehr viel Raum für Mittelung oder Akkumulation. Das große Bildfeld bleibt dabei erhalten.

Hohe Sensitivität für einzelne Moleküle

Fixierte Einzelmoleküle stellen die höchste Herausforderung für hochsensitives Imaging dar. Wenn derart schwache Signale nahe einer reflektierenden Oberfläche aufgenommen werden, gelangen die Sensitivität, das Dunkelrauschen und die Effizienz des gesamten Systems an ihre Grenzen.

Die halbmond-förmigen Elemente und horizontalen Linien im Bild rechts, sind ein Indiz dafür, dass die Moleküle blinken. Dies bestätigt den Einzelmolekülcharakter der beugungsbegrenzten Bildpunkte.

Immobilisierte Fluorophore (Atto 647N) an Glasoberfläche. Mit freundlicher Genehmigung von Anton Kurzn and Dirk-Peter Herten, Junior Research Group Single Molecule Spectroscopy, BioQuant, Universität Heidelberg, Deutschland
Lebende Hefezellen mit GFP-Doppelmarkierung der Kernmembran und der Telomere. Mit freundlicher Genehmigung von Susan M. Gasser, Friedrich Miescher Institut für Biomedizinische Forschung, Basel, Schweiz.

Erhöhte Lebensfähigkeit für empfindliche Proben

Lebende Zellen können unter phototoxischen Auswirkungen durch das Imaging leiden. Während viele zu Grunde liegende Mechanismen inzwischen gut verstanden werden, können die Auswirkungen der Phototoxizität in einem biologischen System immer noch schwer zu bestimmen sein.

Wenn ein Detektor sehr sensitiv ist, bedeutet  dies das die Probe weniger Licht ausgesetzt wird und damit weniger geblichen wird. Sogar sehr heikle Systeme, wie z.B. Hefezellen, können mit dem Leica HyD über eine lange Zeit hinweg aufgenommen werden – bei voller konfokaler Auflösung.

Maximale Dynamische Auflösung durch Photonenzählung

Durch den extrem niedrigen Hintergrund unserer Hybriddetektoren kann durch Photonenzählen so viel Information akkumuliert werden, wie für eine statistische Auswertung notwendig. Beim Photonenzählen verhält sich jedes Pixel wie ein Gefäß, das mit Photonen gefüllt werden kann. Je länger man zählt, desto mehr Photonen werden gesammelt. Die Modi mit höheren Bit-Tiefen, 12 bit und 16 bit, stellen sehr große Gefäße dar: im 12-bit-Modus können 4096 Photonen, im 16-bit-Modus sogar 65356 Photonen gezählt werden. Dadurch wird ein enormer Dynamikbereich mit einer sehr niedrigen Pro-Pixel-Varianz erreicht. Die Anzahl der Photonen wird durch die Look-up-Tabelle (LUT) auf dem Bildschirm dargestellt. In diesem Fall haben die Farben ein physikalisches Äquivalent, nämlich Photonen.

Durch Photonenzählen kann soviel Information akkumuliert werden, wie für eine statistische Auswertung notwendig.
Schnelle und leichte NDD Detektion. Zebrafischembryo: Seitenlinienorgan (GFP), Neuronen (DsRed), Muskel (SHG), Zellkerne (BFP). Mit freundlicher Genehmigung von Lionel Newton, EMBL Heidelberg (Gilmour Lab).

Überlegene Sensitivität für Deep Tissue Imaging

Multiphotonenmikroskopie hat besondere Anforderungen an die Signaldetektion, da das emittierte Licht aus tiefen Gewebeschnitten kommt und von umgebenden Strukturen gestreut wird. Um das Licht so effizient wie möglich aufzunehmen, werden die Detektoren möglichst nah an der Emissionsquelle platziert (non-descanned detection, NDD).

Ein Hybriddetektor in RLD (Reflected Light Detection)-Position erhöht die Sensitivität für hellere Bilder. Dadurch wird weniger Anregungsenergie benötigt, was zur Folge hat, dass die Probe weniger geschädigt wird. Gleichzeitig legt das überlegene Signal-zu-Rauschen-Verhältnis mehr Details aus tieferen Gewebeschichten frei.

An das neue QUAD-Modul lassen sich bis zu vier Hybriddetektoren in RLD-Position koppeln. Dies verleiht mehrfarbigen „Deep tissue“-Experimente größte Flexibilität. Durch den modularen Aufbau können Sie so viel Super-Sensitivität wählen, wie Sie für Ihre schnellen, mehrfarbigen Aufnahmen in NDD-Position benötigen.

Leica HyD SMD – der universelle Detektor für FCS, FLIM, FLCS und super-sensitives Imaging

Analytische Sensitivität ist eine Grundvoraussetzung, um Einzelmoleküle zuverlässig zu detektieren. Leica Microsystems hat einen speziellen Hybriddetektor mit herausragenden Eigenschaften für sämtliche SMD-Methoden (Single Molecule Detection) entwickelt, der vollständig in das SP-Detektionssystem integriert ist.

Ein aktives Kühlsystem, das aus einer internen Peltier-Kühlung und einer zusätzlichen externen Kühlung besteht, reduziert das Dunkelrauschen des Leica HyD SMD noch mehr, wodurch höchste SMD-Datenqualität erreicht wird.

Dieses extrem niedrige Dunkelrauschen und die hohe Quanteneffizienz in Kombination mit der direkten Kopplung an den filterfreien SP-Detektor machen den Leica HyD SMD zum universellen Detektor sowohl für alle SMD-Applikationen als auch anpruchsvolles Imaging.

  • Aufnahme präziser Diffusionsdaten durch kaum vorhandenes Detektor-Afterpulsing

  • Weniger FCS -Artefakte aufgrund weniger Bleichens

  • Minimaler Crosstalk bei Kreuzkorrelationsexperimenten

  • Alle vorhandenen Laserquellen nutzbar

  • Maximale Photonenzählrate durch Direktkopplung am Scankopf

  • Kurzlebige Farbstoffe nutzbar aufgrund minimaler Reaktionszeit (IRT)

 

 

Die flache FCS -Kurve (oben) ist frei von After-Pulsing und erlaubt präzise Konzentrationsmessungen. Die steile FLIM-Kurve (unten) weist auf eine kurze Reaktionszeit (IRT) hin. Dies gestattet schnelle biologische Prozesse zu beobachten.
Dekonvolution führt zu Detailreichen Bildern mit hohem Kontrast. Mitotracker® Red CMXRos (Mitochondrien, gelb), Alexa Fluor® 488 (F-Aktin, grün), DAPI (Zellkerne, türkis). FluoCells® Prepared Slide #1, LifeTechnologies.

Hochauflösung mit HyD und Huygens

Der Leica HyD liefert äußerst scharfe und kontrastreiche Bilder. Für wichtige Entdeckungen möchten Sie jedoch möglicherweise noch mehr Details in ihren Konfokalbildern erkennen. Die super-empfindlichen Hybriddetektoren lassen sich mit der zuverlässigen, mathematischen Huygens-Dekonvolution des Technologiefühers SVI kombinieren. Dies verdoppelt die Auflösung Ihres Hochauflösungssystems Leica TCS SP8 und Sie erhalten brillante, mehrfarbige Bilder, die jedes Detail mit größter Genauigkeit darstellen.

Hybrid Detektor Technologie – Das Beste aus zwei Welten

Photodetektoren übersetzen Licht in elektrisches Signal, was sie zu einem kritischen Element im Aufnahmeprozess macht. Der Leica HyD kombiniert die besten Eigenschaften des klassischen PMT (Photomultiplier-Tube) mit der hohen Empfindlichkeit von APDs (Avalanche-Photodioden). So wird Super-Sensitivität und ein großer Dynamikbereich mit hoher Detektionsgeschwindigkeit und geringem Dunkelrauschen erreicht. 

Dies macht den Leica HyD zum idealen Detektor für alle Proben.

Der Leica HyD Photodetektor vereinigt in sich  Funktionselemente von PMTs und APDs. Seine Photonendetektion ist  äußerst effizient und nahezu ohne Verluste. Sein Dunkelrauschen ist extrem niedrig und ermöglicht dadurch eine effiziente Signalaufnahme. Das Avalanche-Element reagiert unmittelbar und führt zu einem zeitlich sehr scharfen elektrischen Puls. Photonenzählung ist dadurch auch bei hohen Lichtintensitäten möglich.

Mehr Informationen über die HyD-Funktionsweise und Photonenzählung finden Sie in unserem Online-Tutorial.