Die FCS Methode

FCS (Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie) ist eine fluoreszenzbasierte Meßmethode. Fluoreszente Moleküle passieren einen stark fokussierten, fixierten Laserstrahl und werden so für die Fluoreszenz-Emission angeregt. Nachdem die emittierten Photonen ein konfokales Pinhole (Lochblende)passiert haben, werden sie mit hochsensitiven Detektoren erfasst.

FCS -Messungen werden mit dem Leica TCS SMD FCS durchgeführt.


Quantitative Parameter einer Autokorrelationskurve

Die sich bewegenden Partikel verursachen Intensitäts-Fluktuationen. Ihre Autokorrelation enthält Informationen auf der Molekülebene: Die Amplitude der Korrelationskurve zeigt die Partikelzahl. Die Zeit am Wendepunkt enthält Informationen über die Partikelmobilität. Schließlich spiegeln die Steilheit und die Form der Kurve den Diffusionstyp. Partikelkonzentration, Partikelmasse, Viskosität und gebundene Fraktionen können an diesen Parametern abgelesen werden.

Prinzip der FCS-Datenaufnahme und -analyse

  1. Laserlicht an einem festen, definierten Punkt des Interesses (beam parking) regt die fluoreszenten Partikel im Anregungsvolumen an. Die Partikelbewegung innerhalb und außerhalb des konfokalen Volumens verursacht Intensitätsfluktuationen.
  2. Die Aufzeichnung von Intensitätsfluktuationen mit mehreren Detektoren im Einzelphotonen-Zählmodus.
  3. Berechnung der Korrelationsfunktion.
  4. Anpassung des korrespondierenden biophysikalischen Models an die Korrelationskurve. Die daraus resultierenden Parameter von Interesse sind:

    • Partikelkonzentration
    • Diffusionskoeffizient
    • Viskosität
    • Molekulare Masse
    • Bindungskonstante
    • Photophysikalische Eigenschaften

1. Laserlicht an einem festen, definierten Punkt des Interesses (beam parking) regt die fluoreszenten Partikel im Anregungsvolumen an. Die Partikelbewegung innerhalb und außerhalb des konfokalen Volumens verursacht Intensitätsfluktuationen.
3. Berechnung der Korrelationsfunktion<br>4. Anpassung des korrespondierenden biophysikalischen Models an die Korrelationskurve.