FLCS Messungen werden mit dem Leica TCS SMD FLCS durchgeführt.

Für FCS wird im Allgemeinen ein kontinuierlich emittierender Laser eingesetzt. In dem man gepulste Laser verwendet, eröffnen sich weitere, verfeinerte Analysemöglichkeiten wie time-gated FCS oder Fluoreszenz-Lebensdauer FCS (FLCS). Beide Methoden nutzen die zusätzlichen Informationen, die durch die gleichzeitige Messung der Fluoreszenz-Lebensdauer gewonnen werden.

Ein Time-Gate (Zeitfenster) selektiert für die Analyse nur solche Photonen die eindeutig einem Fluoreszenzabfall zugeordnet werden können. Die dadurch erzielte Unterdrückung des Streulichts (Rayleigh, Raman) vom detektierten Signal ermöglicht eine exakte Messung der Konzentration.

1. Entfernung von Detektor-Artefakten durch Lebensdauer-Filterung (FLCS)

Bei FLCS wird jedes Photon statistisch gewichtet je nachdem in welcher Form es zur FCS Datenanalyse beiträgt. Es kann für die Korrektur von Detektor-Artefakten oder von anteiligem Streulicht benutzt werden.

Mit dieser Methode können sogar zwei Färbungen mit komplett überlappenden Emissionsspektren und sehr ähnlichem Diffusionskoeffizienten simultan kontrolliert werden – mit nur einem Detektor.

Probe: GaNacT2-GFP in HeLa-Zellen exprimiert und analysiert mit FLCS.
Wir danken Dr. Matthias Weiss, Dr. Jedrzej Szymanski und Nina Malchus, DKFZ, Heidelberg.

2. Messung <i>in vivo</i>

4. Vergleich der FCS -Kurve (ohne Filterfunktion) mit der FLCS-Kurve (nach Anwendung der Filterfunktion)

3a. Fitten des Fluoreszenzabfalls
3b. Weiterverarbeitung der Filterfunktion