FLIM FRET– Die Methode

FLIM-FRET: Der Molekulare Maßstab

Eine typische Anwendung von FLIM ist FLIM-FRET. FRET ist eine gut bekannte Technik um molekulare Interaktionen zu untersuchen. Es weist Proteinbindungen nach und berechnet intermolekulare Abstände auf der Angstömskala. Das Leica TCS SMD FLIM kombiniert mit dem hochentwickelten FRET Analyseprogramm der SymPhoTime-Software von PicoQuant  ist die solide Basis für Bindungsstudien hoher Qualität.


Der FRET Effekt

Im einem FRET-Experiment werden die potentiellen Bindungspartner mit speziell ausgewählten Fluorophoren markiert. Dabei überlappen das Emissionsspektrum des Donor-Moleküls und das Anregungsspektrum des Akzeptormoleküls.

Wenn beide Interaktions-Partner nur einige Nanometer voneinander entfernt sind, kann der angeregte Donor seine Energie an den Akzeptor abgeben. In der Folge emittiert der Akzeptor ein Fluoreszenz-Photon und die Fluoreszenz-Lebensdauer des Donor-Moleküls verringert sind.

Vorteile von FLIM-FRET

Intensitätsbasierende FRET-Methoden sind recht empfindlich gegenüber Variationen des Expressionslevels und Molekülverteilungen in der Probe. Dies gilt auch für äußere Einflüsse wie Probenbewegungen und die Fluktuation von Anregung.

In dieser Hinsicht birgt FLIM-FRET einen großen Vorteil, da es intern kalibriert ist. Es ermöglicht FRET-Messungen die frei sind von solchen Störungen. Wenn FRET stattfindet, verkürzt sich die Lebensdauer des Donors. Dieser Wert ist ein Maßstab der FRET-Effizienz.

Der Einsatz einer Kombination von FLIM-FRET mit SP FLIM verbessert die Datenqualität und sorgt für noch größere Genauigkeit der quantitativen Daten

Donor und Akzeptor sind durch einen Abstand r >>R<sub>0</sub>
Bei einem kleinen Abstand r~R<sub>0</sub> verursacht FRET Akzeptor-Fluoreszenz.