El camino a la supersensibilidad

  • Imágenes multiespectrales excelentes gracias a su integración en el módulo de detección de Leica SP.
  • Mayor sensibilidad que permite menor cantidad de luz
  • Ideal para imágenes a alta velocidad
  • Resultados cuantitativos con el recuento de fotones individuales
  • Detección en modo desescaneado o no desescaneado
  • Concepto modular de Leica TCS SP8 que permite hasta 4HyDs
  • ¡NUEVO! Leica HyD SMD: el detector universal para FCS, FLIM, FLCS y el procesamiento de imágenes supersensibles
Unión neuromuscular en Drosophila melanogaster marcada con Bruchpilot::mStrawberry. El fondo de la imagen de PMT está borroso a causa del ruido residual amplificado por la proyección máxima, mientras que la imagen HyD no tiene ruido.

Bajo nivel de ruido profundo, alto contraste

Las imágenes de muestras vivas sensibles deben tomarse en condiciones de iluminación reducida y en situaciones óptimas de captación. La reducción del ruido puede ser decisiva a la hora de reconocer detalles ligeramente teñidos. Para que la eficacia de la señal sea máxima, se necesita reducir el ruido profundo, especialmente cuando se acumulan fotones, para obtener más información. De lo contrario, el ruido se acumula en el fondo de la imagen.

Leica HyD ofrece una relación señal-ruido de calidad superior que ayuda a reflejar los detalles más minúsculos de cualquier muestra, incluso los más delicados, como los cortes de tejidos muy diseminados. Al reducir el ruido profundo, el detector Leica HyD aumenta automáticamente el contraste de la imagen. Obtendrá más información y las imágenes estarán listas para su publicación sin que tenga que procesarlas.

HyD de Leica mejora considerablemente el contraste en comparación con los PMT

Muestra: Tubulina
Excitación: Láser de argón de 488 nm, 0,2% de potencia total
Imagen: Acumulación x16
Detección: 500-620 nm
Voltaje de PMT: 800 V
Ganancia de HyD: 100%

La relación de contraste se representó como la relación de intensidad media en la región más oscura (azul) y la más brillante (círculo verde).

Contraste de PMT vs. HyD
De tres a cuatro estados célulares de Caenorhabditis elegans marcadas con EGFP-tubulina.

Imágenes a alta velocidad con alta fidelidad

La monitorización de procesos de desarrollo implica recopilar una serie de imágenes a lo largo del tiempo. Para resolver la formación espacio-temporal de la estructura es necesario encontrar el equilibrio adecuado entre la velocidad de adquisición y la claridad. Junto con el tándem de escáneres pionero de Leica Microsystems, Leica HyD ofrece una calidad de imagen sin precedentes. La frecuencia de línea resonante del tándem de escáneres (8 o 12 kHz) deja espacio cómodamente para los promedios o la acumulación necesarios, al tiempo que conserva la amplitud del campo de visión.

Alta sensibilidad para moléculas individuales

La fijación de moléculas individuales representa el reto definitivo en la captura de imágenes de alta sensibilidad. Al medir señales tan débiles y cercanas a una superficie reflectante, la sensibilidad, el ruido oscuro y la eficacia del sistema de división de rayos se llevan al límite. Fíjese en las formas en media luna y las líneas horizontales de la imagen superior, que muestran que las moléculas se encienden y se apagan. Esto demuestra la naturaleza monomolecular de los puntos de excitación limitados por difracción.

Atto 647N inmovilizado sobre el sustrato de vidrio. Cortesía de Anton Kurz y Dr. Dirk-Peter Herten, Junior Research Group Single Molecule Spectroscopy, BioQuant Institute, University of Heidelberg, Alemania
Células vivas de levadura con doble marcaje mediante EGFP en el envoltorio nuclear y el telómero.

Aumento de la viabilidad celular para las muestras sensibles

Las células vivas pueden padecer efectos fototóxicos como resultado de la captura de imágenes. Mientras que varios de los mecanismos subyacentes son bien conocidos, los efectos de la fototoxicidad resultan difíciles de definir en el sistema biológico del estudio.

Una alta sensibilidad implica que la muestra recibe menos luz y experimenta una menor decoloración. Con el Leica HyD se puede acceder hasta a los sistemas más delicados, como la levadura, a resolución confocal total.

Máxima resolución dinámica mediante recuento de fotones

Debido al ruido de fondo tan reducido de nuestros detectores híbridos, el recuento de fotones permite acumular tanta información como sea necesaria para realizar cualquier tipo de análisis estadístico. En el recuento de fotones, cada píxel se comporta como un recipiente que puede llenarse de fotones. Cuanto más extensos sean los recuentos, más fotones se recopilan. Los modos de profundidad de bits alta, 12 y 16 bits, representan recipientes muy grandes: en el modo de 12 bits se pueden acumular en un píxel 4.096 fotones, en el de 16 bits, 65.356. De esta manera, se consigue un amplio rango dinámico con una variación por píxel muy reducida. El número de fotones se muestra en una tabla de consulta (LUT) que aparece en la pantalla. En este caso, los colores tienen un equivalente físico: los fotones.

El recuento de fotones permite acumular tanta información como sea necesaria para realizar cualquier tipo de análisis estadístico.
Adquisición rápida y fácil de imágenes NDD. Embrión de pez cebra: línea lateral (GFP), neuronas (DsRed), músculos (SHG), núcleos (BFP). Cortesía de Lionel Newton, EMBL Heidelberg (laboratorio Gilmour).

Sensibilidad superior para procesamiento de imágenes de tejidos profundos

La microscopía multifotónica tiene requisitos especiales para la detección de señales, ya que la luz que se emite proviene de cortes de tejidos profundos y se encuentra retrodispersada desde estructuras circundantes.

Para mejorar la eficacia de la recopilación de luz, los detectores se colocan lo más cerca posible de la fuente de emisión (detección no desescaneada, NDD).

Un detector híbrido en posición RLD ofrece una sensibilidad superior en el caso de imágenes más brillantes. Para garantizar el menor daño posible en la muestra se necesita una potencia de excitación menor, mientras que una relación señal-ruido superior muestra más detalles de los cortes de tejidos profundos.

El nuevo módulo QUAD acopla hasta cuatro detectores híbridos en posición RDL, lo que le ofrece la mayor flexibilidad para experimentos de tejidos profundos multicolor. Gracias a esta configuración modular, puede elegir tanta supersensibilidad como necesite para una adquisición rápida, fácil, no desescaneada y multicolor.

Leica HyD SMD: el detector universal para FCS, FLIM, FLCS y el procesamiento de imágenes supersensibles

La sensibilidad analítica es un requisito para que la detección de moléculas individuales sea fiable.

Leica Microsystems ha desarrollado un detector híbrido especial con características superiores para todos los métodos SMD (detección de moléculas individuales) completamente integrado en los sistemas de detección SP. Un sistema de refrigeración activo formado por una refrigeración Peltier incorporada y una refrigeración externa adicional, que reduce el ruido oscuro específico del Leica HyD SMD. El resultado son datos SMD de la más alta calidad.

La extrema reducción del ruido profundo y la elevada eficacia cuántica, en combinación con el detector SP sin filtros directamente acoplado, convierten a Leica HyD SMD en el detector universal para todas las aplicaciones SMD, así como para las tareas de procesamiento avanzado de imágenes.

  • Virtualmente, ningún detector permite adquirir datos de difusión precisos después del pulso
  • Resultados con menos fotoblanqueado provocan menos artefactos FCS
  • Mínimo cruce de datos en experimentos de correlación cruzada
  • La posición desescaneada permite utilizar todos los láseres disponibles
  • El acoplamiento directo ofrece como resultado un recuento elevado de fotones
  • Accesibilidad a marcadores de poco tiempo de vida debido al breve plazo de respuesta del instrumento

 

La curva FCS plana (arriba) muestra pulsos posteriores y permite mediciones precisas de concentraciones. La curva FLIM pronunciada (inferior) indica un tiempo de respuesta del instrumento corto y permite observar procesos biológicos rápidos.
Al aplicar la deconvulación se obtienen imágenes sumamente detalladas con alto contraste.
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Imágenes de alta resolución con HyD y Huygens

Leica HyD ofrece detalles nítidos de las imágenes, con contraste de profundidad. Sin embargo, para tareas de investigación en profundidad podría necesitar más detalles de los experimentos confocales. Al combinar nuestros detectores híbridos supersensibles y la deconvolución Huygens matemática de confianza del líder en tecnología SVI, el sistema de obtención de imágenes de alta resolución TCS SP8 de Leica duplica fácilmente la resolución de su microscopio confocal y ofrece imágenes nítidas multicolor que transmiten todos y cada uno de los detalles en alta fidelidad.

Tecnología de los detectores híbridos,
lo mejor de ambos mundos

Los fotodetectores traducen la luz en señales eléctricas, lo que los convierte en una parte fundamental del proceso de grabación. Leica HyD combina las mejores características del PMT clásico con los detectores de fotodiodos de avalancha (APDs). Esto deriva en una gran sensibilidad y un gran rango dinámico combinado con una rápida velocidad de detección y reducción del ruido oscuro, que los convierte en los detectores perfectos para todo tipo de muestras.

Los fotodetectores de Leica HyD combinan elementos funcionales que se utilizan en PMT y APD. La detección de fotones de HyD es muy eficaz, ya que, prácticamente, no se produce pérdida de electrones. El nivel de ruido profundo es muy reducido, lo que permite una recuperación eficaz de la señal. El elemento de avalancha permite una respuesta inmediata y un pulso eléctrico muy fuerte. También es posible el recuento de fotones, incluso en intensidades altas.

Encontrará más información sobre la función HyD y el recuento de fotones en nuestro tutorial en línea.