Método de Espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)

FCS es un método de medición basado en fluorescencia. Las moléculas fluorescentes que atraviesan un haz de láser fijo de enfoque intenso se excitan para la emisión de fluorescencia. Tras atravesar el "estenopo" confocal, los fotones emitidos se registran utilizando detectores muy sensibles.

Las mediciones de FCS se realizan con el sistema Leica TCS SP8 SMD.


Parámetros cuantitativos derivados de curva de autocorrelación

Las partículas en movimiento provocan fluctuaciones de intensidad. Su autocorrelación revela información sobre la escala molecular: la amplitud de la curva de correlación muestra el número de partículas. El tiempo en el punto de inflexión contiene información sobre la movilidad de las partículas. Por último, la pendiente y la forma de la curva reflejan el tipo de difusión. La concentración de partículas, la masa de partículas, la viscosidad y la fracción ligada se pueden derivar de estos parámetros.

Principio de análisis y adquisición de datos FCS 

 

  1. La iluminación por láser en un punto de interés fijo (estacionamiento de haz) excita partículas fluorescentes en el volumen de excitación. El movimiento de partículas dentro y fuera del volumen confocal provoca fluctuaciones de intensidad.
  2. Registro de fluctuaciones de intensidad utilizando detectores en modo de recuento de fotones individuales.
  3. Cálculo de la función de correlación.
  4. Ajuste del modelo biofísico correspondiente a la curva de correlación. Obtenga parámetros de interés:

    • concentración de partículas
    • coeficiente de difusión
    • viscosidad
    • masa molecular
    • constante de unión
    • propiedades fotofísicas

1. Laser illumination at a fixed point of interest (beam parking) excites fluorescent particles in the excitation volume. The particle movement in and out of the confocal volume causes intensity fluctuations.
3. Calculation of the correlation function<br>4. Fitting of the corresponding biophysical model