FLIM FRET– Método

FLIM-FRET: la regla molecular

 

Una aplicación típica de FLIM es FLIM-FRET. FRET es una técnica firmemente consolidada para estudiar interacciones moleculares. Verifica los detalles de la unión de proteínas y también estima las distancias intermoleculares a escala de Angströms. El sistema Leica TCS SP8 SMD, junto con las herramientas avanzadas de análisis de FRET integradas en el software SymPhoTime de PicoQuant, forma una sólida base para llevar a cabo dichos estudios con una gran calidad.


El efecto FRET

En un experimento de FRET, los ligandos potenciales se marcan con fluoróforos espectralmente característicos de tal forma que el espectro de emisiones de la molécula donante se solapa con el espectro de excitación de la molécula receptora.

Si ambos ligandos de interacción están en estrecho contacto a una distancia de tan solo unos pocos nanómetros, el donante excitado puede transferir su energía al receptor. Por su parte, el receptor emite un fotón de fluorescencia y se reduce el tiempo de vida de fluorescencia de la molécula donante.

Motivación para FLIM-FRET

 

Los métodos de

FRET basados en intensidad son bastante propensos a variaciones en el nivel de expresión o de difusión de moléculas inherente en la muestra. Esto también se aplica a influencias externas, como los movimientos de muestras y la fluctuación de excitación.

En relación con lo anterior, FLIM-FRET supone una gran ventaja ya que se calibra internamente. Permite mediciones de FRET independientes de dichas perturbaciones. Si se produce FRET, se observa un acortamiento del tiempo de vida del donante. Este valor es una medida de la eficiencia de FRET.

La combinación de FLIM-FRET con SP FLIM se puede utilizar para mejorar la calidad de los datos y aumentar la precisión de los datos cuantitativos.

El donante y el receptor están separados por una distancia r >>R<sub>0</sub>
A una distancia pequeña r~R<sub>0</sub>, FRET provoca la fluorescencia del receptor