Las mediciones de FLIM se llevan a cabo con el Leica TCS SP8 SMD con configuración para FLIM.

Definición del tiempo de vida de fluorescencia

 

El tiempo de vida de fluorescencia es una medida del tiempo que un fluoróforo permanece de media en su estado excitado antes de regresar al estado estacionario emitiendo un fotón de fluorescencia. La emisión de un fotón de fluorescencia a partir de un fluoróforo no se produce en un momento fijo. En su lugar, se observa una distribución de momentos, que se pueden describir mediante una función de disminución exponencial. La constante de tiempo característica de esta disminución, el tiempo de vida de fluorescencia, está en el rango de unos pocos picosegundos (10-12 s) hasta varias decenas de nanosegundos (10-9 s).

Tiempo de vida de fluorescencia como prueba para nanoentorno 

 

Este tiempo de vida es un parámetro característico de cada marcador de fluorescencia que puede cambiar con su microentorno o su estado conformacional. La información de tiempo de vida prueba el entorno molecular para comprobar su composición, como la concentración iónica, el pH, la lipofilicidad o la unión a otras moléculas.

Combinación de medición de tiempo de vida y obtención de imágenes 

 

FLIM combina mediciones de tiempo de vida con obtención de imágenes: los tiempos de vida obtenidos en el nivel de píxeles se codifican por colores para producir imágenes. De esta forma, FLIM proporciona información sobre la distribución espacial de una molécula fluorescente junto con información sobre su nanoentorno. Así se obtiene una dimensión de información adicional.

Principio de análisis y adquisición de datos FLIM 

 

  1. Medición repetida del tiempo entre impulso de láser y fotón de fluorescencia en cada píxel.
  2. Cálculo de un histograma de recuentos de fotones respecto al tiempo de llegada tras el impulso de láser.
  3. Ajuste de una disminución exponencial de cada histograma. La amplitud refleja el número total de fotones, la constante de tiempo τ se denomina el ciclo de vida de fluorescencia.
  4. Visualización de imagen de tiempo de vida utilizando una tabla de consulta en falso color.
Análisis y adquisición de datos FLIM, Paso 1 Pasos 2 y 3 Paso 4