Divisores de haz

Un reto fundamental en la microscopía de fluorescencia que incluye la microscopía confocal es la separación de la luz de excitación, por ejemplo de un láser, y la luz fluorescente de la muestra. La luz de excitación debe pasar por la muestra sin trabas y nada debe contaminar la señal de fluorescencia, que es más débil (en un factor de 10-5 [consulte la figura 1]). Para hacernos una idea, esta relación es similar a la intensidad luminosa de una vela pequeña frente a veinte lámparas halógenas de 1.000 W. Para garantizar la detección de la luz fluorescente sin contaminación de la luz de excitación, el divisor de haz es el componente crucial para contrastar la imagen en la trayectoria del haz. Para una visión general de varios tipos de divisores de haz en la microscopía confocal, consulte el correspondiente artículo de Rolf Borlinghaus en Leica Science Lab. Ahora nos centraremos en los tipos concretos de divisores de haz que utiliza el Leica TCS SP8.

Figura 1: Divisor de haz en microscopía de fluorescencia La luz de excitación (flecha azul) se acopla a la trayectoria de la luz mediante un espejo dicroico y se transmite a la muestra. Parte de ella se vuelve a reflejar en el divisor de haz, donde se bloquea. La mayor parte excita fluorescencia (flecha con rayas rojas) que pasa por el divisor de haz y se detecta. Observe la gran diferencia en intensidad entre la luz de emisión y de excitación de cinco órdenes de magnitud.


LIAchroics

LIAchroics constituyen una mejora de los divisores de haz dicroicos. Estos últimos actúan como un espejo semitransparente que selecciona la longitud de onda, es decir, la luz azul se refleja, mientras que la verde pasa a través de ellos. Esto significa que los espejos dicroicos, como también se denominan, se seleccionan según el desplazamiento de Stokes de un marcador fluorescente. Las propiedades espectrales concretas de un divisor de haz se determinan mediante una capa fina de recubrimientos ópticos en un sustrato de cristal. Los divisores de haz dicroicos son filtros de interferencia. El recubrimiento es fijo, por lo tanto, para cada combinación de marcador/láser se requiere un divisor de haz específico. Para ello se suele colocar un conjunto de filtros en un disco o deslizador móvil para moverlo dentro y fuera de la trayectoria del haz según sea necesario. Como se ve en la figura 1, el diseño tradicional utiliza un ángulo de 45° para el espejo dicroico, lo que facilita la separación geométrica de la luz de emisión y excitación, al ser sus haces ortogonales. Sin embargo, este diseño no es igual de permisivo en distintos ángulos de la luz polarizada (de forma lineal). Como consecuencia, se pierde una parte de la luz fluorescente; lo que ocurre es que su plano de polarización tiene la orientación “equivocada”. La explicación es el denominado ángulo de Brewster. Que la luz se transmita o refleje en una interfaz de aire-cristal depende de su ángulo de incidencia. Para las interfaces de aire-cristal, el ángulo de Brewster es alrededor de 56°, demasiado cerca de los 45° que se utilizan normalmente para los espejos dicroicos. Aquí encontrará unas bonitas representaciones de interfaces aire-cristal realizadas por Srihari Angaluri y Kiril N Vidimce. Cuando el ángulo de la luz incidente es mucho menor que 45°, este efecto se elimina. Por lo tanto, los divisores de haz LIAchroic, o dicroicos de luz de baja incidencia, mejoran el contraste y la sensibilidad en comparación con los anteriores divisores de haz. Los LIAchroic tienen un diseño personalizado y son de producción propia para garantizar la eficiencia asequible de la división del haz.

AOBS

A pesar de los recientes avances en la producción de espejos dicroicos, aún persisten dos trabas inherentes: Al ser filtros, siempre pierden cierta luz fluorescente y su confinamiento para cierta longitud de onda limita la flexibilidad del instrumento confocal. La pérdida de luz en los dicroicos ocurre no solo por la transmisión inferior al 100 % sobre la longitud de onda de división, sino sobre todo por las características de los filtros cerca de esta longitud de onda. Normalmente los divisores de haz dicroicos suprimen una banda alrededor de la longitud de onda del láser de unos 20 nm de ancho. Como esta región espectral suele contener el máximo de emisión del espectro de un marcador, se perderá luz (consulte la figura 2, zona amarilla de la fila superior).

Figura 2: Características del filtro del antiguo divisor de haz dicroico doble en comparación con AOBS. Se suprime una banda espectral alrededor de la longitud de onda del filtro nominal (blanco frente a azul claro). Se detecta la luz fluorescente que pasa por el filtro (azul oscuro-verde), mientras que se pierde algo de luz (amarilla). Debido a su corte pronunciado, el AOBS apenas sufre esta deficiencia inherente a los divisores de haz dicroicos.

Una solución a este dilema es el uso de un concepto sin filtro para la división del haz. Con el divisor de haz acústico-óptico (AOBS) Leica ha introducido una tecnología divisora de haz que actúa simultáneamente como multiplexor para varias longitudes de onda (figura 3).

Figura 3: Divisor de haz acústico-óptico (AOBS, Acousto-optical beam splitter) Un cristal fabricado con óxido de telurio (TeO2) homólogo del cuarzo actúa como deflector específico de la longitud de onda. Para ello, se acopla una onda acústica del rango de kHz en el cristal, cambiando así sus propiedades de dispersión. Este principio se aplica a hasta ocho longitudes de onda a la vez mediante la superposición de varias frecuencias acústicas. El principio físico subyacente se basa en deformaciones de la red cristalina, incluidos sus electrones. Interactúan con el campo eléctrico de la luz incidente y, por lo tanto, lo guían de forma distinta en función del desplazamiento respectivo de los electrones.


En la práctica, especialmente en la obtención de imágenes multiespectrales, el corte pronunciado del AOBS divide el haz de forma más eficaz al permitir la detección de mayor cantidad de luz (figura 4). Además, al utilizar espejos dicroicos, ciertas combinaciones de marcadores, como un triple marcado de GFP, YFP y mCherry, no pueden grabarse simultáneamente. Por tanto, no existe dicha combinación de filtro, lo que limita la flexibilidad experimental para combinar libremente cualquier marcador fluorescente (figura 5A). De nuevo, el corte pronunciado del AOBS contribuye al cumplimiento de este requisito, puesto que permite grabar en paralelo incluso bandas de emisión muy estrechas, con el respaldo del sistema de detección sensible del Leica TCS SP8 (figura 5B). Aquí se ofrece un ejemplo de célula viva con GFP, YFP y mCherry que se está grabando simultáneamente. Son posibles incluso más combinaciones gracias a que el AOBS puede reprogramarse a una longitud de onda distinta en microsegundos y hasta dividirse simultáneamente en 8 líneas de láser. Por lo tanto, la exploración secuencial en línea permite más grabación multicanal pseudosimultánea además de las simultáneas descritas anteriormente. La exploración secuencial no es posible con todas las combinaciones de filtros dicroicos en contraste. Gracias a estas propiedades, el AOBS es ideal para varias configuraciones de láser, donde son posibles 8! = 40.320 combinaciones distintas. Esto se aplica especialmente en el láser de luz blanca (WLL2), donde literalmente existen billones de combinaciones de excitación y la idea de un confocal blanco totalmente ajustable se convierte en realidad.

Figura 4: Eficiencia luminosa del AOBS. Fila superior: excitación (líneas punteadas) y espectros de emisión (líneas sólidas) en muestras multicolores con Cy2 (verde), Cy3 (amarillo) y Cy5 (rojo), respectivamente. Las zonas rellenas representan la fluorescencia transmitida a > 90 % de la transmisión de divisores de haz dicroicos (A) y el AOBS (B). La fluorescencia detectable se integra y se expresa en relación con el espectro de emisión integrado del marcador respectivo (C). El AOBS transmite una parte mayor de la luz fluorescente (C, barras rojas) en comparación con los dicroicos (C, barras azules).

 

Figura 5: Flexibilidad y velocidad a través del AOBS. Los espectros GFP, YPF y mCherry aparecen en verde, amarillo y rojo, respectivamente, como en la figura 4. Ninguna combinación de espejos dicroicos puede grabar los espectros de emisión tan solapados de GFP y YFP simultáneamente. El solapamiento de las bandas de longitud de onda dicroica típicas aparece en la zona punteada, por lo que no existe espacio para la excitación necesaria de 514 nm. Al contrario, el AOBS captura ambos espectros en paralelo, ya que permite bandas de detección muy estrechas junto con el detector SP y opcionalmente con HyD.

Ejemplo de célula viva