Escáner de campo visual (FOV)

Consígalo con una sola captura

 

Aunque los microscopios se han inventado para investigar pequeños detalles, a menudo hay que situarlos en contexto. Esto requiere ver una zona más amplia del entorno. El tamaño de la zona visible de una imagen microscópica se determina por el campo visual (FOV) del microscopio. El diseño óptico, que consta de las lentes del objetivo, la óptica de escaneado y el sistema de escaneado, afecta al campo visual de los instrumentos confocales. Para la compatibilidad con un gran campo visual, el reto técnico es iluminar de forma homogénea la zona sin perder resolución del centro al borde.

Iluminación homogénea en un microscopio de exploración láser confocal

 

En la versión más simple de un microscopio de exploración con láser tenemos una lente de objetivo OL y un espejo de exploración MSc (figura 1). En este diseño, si se inclina ligeramente el espejo de exploración, lo que es necesario para el proceso de exploración, la pupila de la lente del objetivo (que se muestra como una apertura naranja) ya no se llena completamente. Por lo tanto, los bordes de la imagen no se iluminan correctamente. Esto implica una pérdida de intensidad y de resolución.


Figura 1 Además del objetivo, los sistemas confocales suelen utilizar también una lente de tubo TL situada a la distancia fTL del plano retrofocal del objetivo y una lente de exploración ScL situada a la distancia fScL del plano retrofocal de la lente de tubo para obtener iluminación limitada de difracción (figura 2). Si a continuación se coloca el espejo de exploración a la distanciafScL de la lente de exploración, hablamos de un “diseño 4 f”, ya que se cubren cuatro distancias focales f entre el objetivo y el espejo de exploración. A continuación siempre se rellena la pupila por completo en todas las posiciones del espejo de exploración, lo que produce una iluminación homogénea de todo el campo.

Figura 2: Evitar el viñeteado o la pérdida de resolución periférica al utilizar un diseño de escáner 4f. La lente de exploración (ScL) y la lente de tubo (TL) se colocan para poder conjugar el espejo de exploración (MSc) con la pupila posterior de la lente del objetivo (OL).

En un sistema confocal con dos espejos de escaneado, uno para la dimensión x y otro para la dimensión y, hay que encontrar un equilibrio al situar los espejos de escaneado. O bien un espejo de exploración o bien los dos se salen fuera del plano conjugado. Esto limita el campo útil, ya que se pierde intensidad y resolución hacia los bordes del campo.

A diferencia de otros sistemas de escaneado confocales, el escáner Leica X2Y integrado en Leica TCS SP8 utiliza tres espejos de escaneado, uno para la dimensión x y dos para la dimensión y. El segundo espejo Y del escaneado X2Y garantiza que el punto giratorio del haz de luz en la pupila posterior de OL se encuentre siempre centrado. Con esta disposición se mantiene el diseño óptimo 4f para evitar el viñeteado y la pérdida de resolución (figura 3).

Figure 3 X2Y scanner design to maximize field of view by introducing a second Y-galvanometer mirror. The X2Y-system ensures the pivot-plane of the scanning beam is not moving laterally. This avoids image degradation off-center that occurs, when the mirror is not placed in a plane conjugated to the back focal plane.

Los sistemas de escaneado XY tienen el tamaño de campo limitado, pero con el sistema de escaneado del Leica X2Y el número f aumenta hasta 22. Con una magnificación de 10x esto equivale a un cuadrado de 1,5 x 1,5 mm2. Un campo visual más grande permite encajar una toda una muestra de mayor tamaño en una sola imagen o simplemente añadir más contexto a una topología compleja, como una muestra de tejido (figura 4).

Figura 4: Platynereis dumerilii, 2 meses. Azul: núcleos, DAPI. Verde: tubulina, FITC. Gris: faloidina, rodamina. Rojo: serotonina, Cy5. El organismo entero cabe en una sola imagen (FOV). Proyección máxima en 3D de una imagen tomada con un objetivo 10x con el mínimo zoom y un formato de escaneado de 5000x5000. Muestra: cortesía del Dr. Antje Fischer y el Dr. Detlef Arendt, Heidelberg, Alemania