Estenopo cuadrado

La microscopía confocal permite grabar secciones ópticas. Esto es posible gracias a una apertura variable situada en el plano focal conjugado (plano confocal) del eje óptico: el estenopo de detección confocal. Bloquea la luz desenfocada para que no llegue al detector, lo que mejora la resolución a lo largo del eje óptico (dirección Z) en un factor de aproximadamente 1,4 en comparación con la microscopía widefield (para ver más información sobre la trayectoria óptica de un microscopio confocal, consulte el Leica Science Lab). En el plano confocal, cada punto de la muestra aparece como un patrón de difracción típico también conocido como patrón de Airy (figura 1), y a la difracción central máxima se la conoce como disco de Airy. La luz desenfocada se representa como el máximo de mayor orden del patrón. Normalmente, el estenopo cuadrado se ajusta para permitir que el máximo principal, la luz enfocada, llegue al detector para la grabación. A este ajuste se le conoce como 1 unidad de Airy.


Por otro lado, como al añadir el estenopo se pierde luz, sería deseable tener un estenopo de tamaño ajustable para equilibrar la ganancia de resolución y la pérdida de luz (para ver detalles sobre la resolución y las unidades Airy, consulte el Leica Science Lab). Un diámetro ajustable de estenopo es técnicamente difícil de realizar para una geometría perfectamente circular, por lo que se prefieren otras geometrías. La forma más común es la geometría hexagonal del estenopo, similar a las aperturas en los objetivos utilizados en la fotografía. En el plano confocal aún no se ha detectado la luz, pero debe pasar al sistema de detección, donde se divide junto con la dimensión espectral para la obtención de imágenes multiespectrales. Tras la dispersión de la luz, mediante un prisma en los confocales Leica, cada color produce un patrón de difracción único (figura 2). Cuanto mejor estén separados sus máximos principales, mejor será la potencia de resolución espectral del microscopio confocal. La geometría del estenopo afecta en gran medida al patrón de difracción (figura 3, fila superior). Una disposición cuadrada de estenopo resulta muy beneficiosa para eliminar el máximo secundario problemático y, por lo tanto, mejorar la resolución espectral (figura 3, fila inferior). En la microscopía de fluorescencia, cada estructura (biológica) de interés se marca específicamente con un color único y su colocalización transmite información importante sobre la función biológica. Por lo tanto, la especificidad espectral mediante un estenopo cuadrado mejora la caracterización funcional de la muestra multicolor.

Figura 1: El estenopo confocal induce un patrón de difracción en el plano confocal. Una unidad Airy se define como su máximo principal (orden cero) y es el equivalente físico de la luz enfocada. Al cambiar el tamaño del estenopo se equilibra la resolución óptica y la intensidad de la luz. El tamaño físico del estenopo depende de la geometría exacta de la trayectoria del haz y de la ampliación de la óptica. Por lo tanto, las unidades Airy son más útiles para comparar los tamaños del estenopo que su diámetro físico.


Figura 2: Patrones de difracción para dos colores tras pasar por un prisma. En la obtención de imágenes multiespectrales, la especificidad espectral se ve afectada por la capacidad de resolver dos patrones de difracción adyacentes.

Figura 3: Patrones de difracción causados por distintas geometrías de estenopo (ilustración esquemática basada en patrones de difracción computados). Fila superior: estenopo circular (A), hexagonal (B) y cuadrado (C). Fila inferior: Separación de dos patrones adyacentes, como los que causan distintos colores para las geometrías circular (D), hexagonal (E) y cuadrada (F). La separación de colores es importante para la obtención de imágenes multiespectrales. Gracias a su falta de intensidad entre los dos máximos de difracción de primer orden, la geometría cuadrada del estenopo permite suprimir órdenes superiores más fácilmente. La ganancia en la separación espectral es aproximadamente 1,5 (patente de EE. UU. 6.801.359 B1).