Láseres para microscopía confocal

Desde siempre, la microscopía confocal requiere fuentes de luz con alto brillo y un perfil de haz que se centre fácilmente en un punto de difracción limitada. Estos criterios se cumplen mejor con láseres (acrónimo de Light Amplification by Stimulated Emission of Light, Amplificación de la luz por emisión estimulada de radiación), que es la razón por la que todos los microscopios confocales comerciales utilizan láseres como fuentes de luz.

En cuanto a la realización técnica se distinguen varios tipos de láser. Las clases importantes son los láseres semiconductores, los láseres de estado sólido, los láseres de gas y los láseres de fibra. Para simplificar, los láseres semiconductores se considerarán también como láseres de estado sólido. Leica emplea todos estos tipos de láser en función de las necesidades de la aplicación. A continuación se ofrece una visión general con enlaces para futuras consultas.


Principios generales

 

 

El principio común subyacente a todos los láseres es la emisión estimulada. Este término hace referencia a todo tipo de emisión “forzada”, por ejemplo, con luz, en oposición a la emisión espontánea, que es la base de la fluorescencia. La emisión estimulada requiere
la (super)población de un estado cuántico excitado a partir del cual se produce esta
. En condiciones normales de una distribución de Boltzmann entre el estado básico y el excitado, la emisión estimulada es un proceso muy raro. Por lo tanto, los láseres requieren una inversión de la población de equilibrio, es decir, el estado excitado debe poblarse más que el estado básico. Para alcanzar esta distribución sin equilibrio, la energía se transfiere de un nivel mayor de energía acoplada, por ejemplo, en otro material, un proceso conocido como bombeo. En función de la estructura física del láser, el bombeo se logra con luz (bombeo óptico) o con un campo eléctrico. Los fotones emitidos provocan más emisión, lo que provoca la autoamplificación. Por lo tanto, los láseres normalmente producen luz coherente (luz en fase, ya que se emite al mismo tiempo). Por ello, la emisión estimulada también es el principio subyacente al agotamiento de emisión estimulada (STED) aplicada a la microscopía de superresolución. En Leica Science Lab encontrará una visión general de los láseres que se utilizan en la microscopía confocal.

Láseres de estado sólido

 

 

Por definición, el medio activo (también conocido como medio de láser activo) en un láser de estado sólido es un sólido (en oposición a un gas, por ejemplo). Los láseres de estado sólido son un tipo de láser establecido. De hecho, el primer láser, que fabricó Theodore Maiman en 1960, utilizaba un cristal de rubí bombeado ópticamente como material activo. Si el bombeo se realiza electrónicamente en un semiconductor, el láser se denomina láser de diodo. En caso de que el bombeo se realice a través de la luz (bombeo óptico), se conoce como láser de estado sólido bombeado con diodo o bombeado ópticamente.

Existe una amplia variedad de láseres de diodo a un precio razonable, por lo que son perfectos para sistemas de obtención de imágenes confocales básicos. En el Leica TCS SP8 se utilizan varios tipos de láser de estado sólido. Son muy estables, generan muy poco calor y, por lo tanto, no necesitan refrigeración. La unidad de suministro compacta del Leica TCS SP8 contiene un conjunto de láseres de diodo y láseres de estado sólido bombeados ópticamente con base reducida, mientras que la unidad de suministro flexible permite combinar láseres de gas con láseres de estado sólido bombeados ópticamente, aunque requiere más espacio y mejor refrigeración.

Láser de estado sólido para longitudes de onda mayores de 680 nm

 

 

En el lado opuesto de la escala, técnicamente y en cuanto a longitud de onda, se encuentran los láseres de infrarrojos con impulso de femtosegundo, como los láseres de titanio-zafiro que utilizan cristales de zafiro con titanio como material activo (consulte la imagen de Wikipedia). Tienen longitudes de onda de emisión ajustable de aproximadamente 680 nm – 1.050 nm y se utilizan para obtener imágenes multifotónicas de más profundidad en los tejidos a medida que se reduce la dispersión de longitudes de onda más largas. Asimismo, los láseres de titanio-zafiro se utilizan para la fotoactivación y la microdisección con láser.

Una variante especial son los osciladores paramétricos ópticos (OPO), que amplían el rango de longitud de onda a 1.300 nm y más. No son láseres realmente, pero requieren un láser, que suele ser de titanio-zafiro, como el láser de bomba. En la microscopía multifotónica se utilizan para excitar proteínas rojas fluorescentes o para aplicaciones concretas, como CARS, que produce un contraste químico.

Tanto los láseres de titanio-zafiro como los OPO son láseres de impulsos con longitudes de impulso de unos 70-200 fs. Esto garantiza que las potencias máximas sean lo bastante elevadas como para producir efectos multifotónicos, pero la potencia media sigue siendo suficientemente baja como para mantener la viabilidad de la célula.

Encontrará más información sobre los láseres de infrarrojos y su aplicación en los siguientes artículos de Science Lab:

 

 

 

 

 

Láseres de gas

 

Aquí el material activo es una cavidad llena de gas. Debido a la naturaleza de las transiciones de energía atómica, las líneas de láser que produce un láser de gas son especialmente monocromáticas, lo que permite el mejor contraste de imagen de los láseres de onda continua. Algunos gases, como la mezcla de argón y criptón, poseen varios niveles de energía que se activan simultáneamente y ofrecen una fuente multilineal de 458 nm a 514 nm. En el caso del láser de argón, el gas se transforma en un plasma, es decir, en gas ionizado sobrecalentado con conductividad eléctrica, del que Leica TCS SP8 utiliza de tres a cinco longitudes de onda, en función del divisor de haz.

Otro tipo importante de láser de gas utilizado con en Leica TCS SP8 es el láser de helio-neón (HeNe). En este tipo de láser, el helio sirve de medio de bombeo, mientras que el neón es el material activo. El helio se excita eléctricamente y transfiere la energía de la bomba a átomos de neón mediante colisiones. Los láseres HeNe se suelen utilizar sobre todo en el rango naranja y rojo, mientras que los HeNe verdes se han sustituido por láseres de estado sólido más potentes. Si desea más información, consulte el artículo sobre el láser de helio-neón en Wikipedia.

Láseres de fibra

 

El término láser de fibra hace referencia a la estructura del medio activo o fibra que modifica la luz del láser. Para los Leica TCS SP8 X y Leica TCS SP8 STED con STED sincronizado se emplean láseres denominados supercontinuos (láseres de luz blanca). El término supercontinuo hace referencia a la presencia de efectos no lineales en la fibra fotónica que convierten la longitud de onda de una fuente de bombeo en un amplio espectro. El láser supercontinuo implementado produce un espectro blanco que se ajusta libremente desde 470 nm a 670 nm.

Las fuentes convencionales de láser proporcionan uno o un pequeño número de líneas de longitud de onda individual. En consecuencia, los amplios vacíos en el espectro de excitación limitan la flexibilidad de excitación de marcadores no estándar y nuevas proteínas fluorescentes. Por otro lado, las fuentes de luz, como las lámparas halógenas o de halogenuro metálico, producen un amplio espectro pero no son adecuadas para la microscopía confocal debido al brillo limitado y a la falta de coherencia.

El láser de luz blanca ofrece de manera eficaz las características de flexibilidad y ancho de banda de una fuente de lámpara que se combina con el brillo y la coherencia de un láser. La implementación de Leica combina esta fuente ajustable con el también ajustable divisor de haz AOBS y la detección multiespectral. Así, el usuario controla todos los aspectos del proceso de fluorescencia, como la longitud de onda de excitación, la selección de la línea, la combinación de colores y la banda de detección. El ajuste en tiempo real con hasta ocho líneas simultáneamente ofrece literalmente billones de combinaciones para configuraciones de excitación del láser. Como el láser de luz blanca es una fuente de impulsos, también se utiliza como fuente flexible para captación de tiempo de vida de imagen fluorescente, especialmente para cubrir la parte difícil, de verde y amarilla a naranja, del espectro.

Leica va un más allá de estas aplicaciones más obvias y utiliza las propiedades de WLL para muchas aplicaciones nuevas. Gracias a la capacidad de realizar ajustes a escala de µs, el sistema graba espectros de excitación-emisión bidimensionales, que añaden otra dimensión para separar los fluoróforos y la caracterización de los componentes fluorescentes de una muestra. Además, en combinación con HyD como detectores de recuento de fotones, la luz fluorescente se separa en varios componentes mediante un mecanismo de time-gating (LightGate). Por lo tanto, cada canal facilita más información sobre componentes derivados del reflejo, tinciones fluorescentes y autofluorescencia, en función del tiempo de vida de la fluorescencia correspondiente. Es posible suprimir el reflejo sin filtro y desenmarañar complejas mezclas de especies de fluorescencia. Combinándola con sistemas STED, esta tecnología de activación aumenta la superresolución a menos de 50 nm. Lectura adicional sobre WLL:

  • Para obtener información sobre la generación supercontinua, el ajuste de la longitud de onda, las exploraciones de excitación-emisión y Lightgate, consulte el artículo de Rolf Borlinghaus y Lioba Kuschel en Leica Science Lab.