Lentes de objetivo para obtención de imágenes confocales

La captación de imágenes confocales necesita las lentes de objetivo más exigentes. Para beneficiarse totalmente de la resolución de la imagen confocal, el punto focal que crea el objetivo debe tener un límite de difracción para aplicar completamente el rango de longitud de onda y el campo visual. La apertura numérica (NA), la corrección cromática y la planitud de campo son parámetros importantes de los objetivos para la obtención de imágenes confocales.


Apertura numérica

La apertura numérica (NA) determina el poder de resolución y el brillo de la imagen. Es una medida para el ancho y la profundidad del punto focal que produce el objetivo. Se define como el seno del ángulo de media apertura a de la lente y el índice de refracción n del medio de inmersión (figura 1). Según esta definición, cuanto mayor sea la apertura numérica, más estrecho es el punto focal y, por lo tanto, mayor es la potencia de resolución.

Como la NA aumenta de forma lineal con el índice de refracción n, para una NA mayor que 1 se requiere un medio de inmersión con un índice de refracción mayor que 1, es decir, distinto del aire. Una NA mayor normalmente requiere un diseño más complejo que conlleva más elementos de lentes y tolerancias más estrictas. La figura 2 compara los enfoques que producen objetivos 40x con distintas NA mediante sus funciones de dispersión de punto (PSF, Point Spread Functions).

Figura 1 Definición de la apertura numérica (NA). La NA es una medida del ancho del punto focal. Depende del seno del ángulo de media apertura alfa y del índice de refracción n del medio de inmersión. NA = n • seno alfa (con n=1 para aire).

Figura 2 Comparación de los tamaños del punto focal como función de la apertura numérica. Las funciones de extensión del punto calculado trazan intensidades normalizadas frente a dos coordenadas espaciales. Las NA mayores conllevan más potencia de resolución, indicada por el menor tamaño del punto.

Corrección cromática

Una lente ideal enfocaría una fuente de luz de punto con una PSF ideal cuyas dimensiones se determinarían con la NA del objetivo y la longitud de onda de la luz. Sin embargo, la forma y posición de una PSF real se desvían de una PSF ideal a causa de las imperfecciones de las lentes reales. Los resultados de estas imperfecciones se denominan aberraciones. Las aberraciones responsables de una forma no ideal de la PSF tienen un impacto negativo en la resolución y el contraste (aberración esférica, coma, astigmatismo). Una posición desplazada de la PSF conlleva una geometría de imagen (curvatura, distorsión) subóptima o brillo de imagen y solapamiento cromático (aberración cromática en las direcciones lateral y axial).

El corte en z y la obtención de imágenes multiespectrales son muy exigentes, por lo que en la captación de imágenes confocales, las aberraciones cromáticas y la curvatura merecen especial atención. Las aberraciones cromáticas se reducen con diseños de lentes especiales para que las distintas longitudes de onda se enfoquen en el mismo punto en las dimensiones xy y z. Cualquier desviación respecto a lo ideal reduce la calidad de los experimentos de colocalización en la caracterización funcional, ya que se pueden extraer conclusiones falsas del correspondiente coeficiente de correlación. Además, con una mejor corrección cromática la luz se recoge de modo más eficiente gracias al mayor solapamiento entre la PSF de excitación y de emisión (consulte la figura 3).

Figura 3 Ilustración de cómo la señal confocal depende de aberraciones cromáticas (computado). Se parte de una lente 63x / 1,40 NA ideal con radio de Airy ~ 190 nm, estenopo infinitamente pequeño y excitación a 405 nm

Un tipo de objetivo para la exploración confocal: HC PL APO CS2*

Se corrigen mejor las aberraciones cromáticas, esféricas u otras al introducir más elementos de lentes, pero eso requiere más precisión en la fabricación. Por lo tanto, el diseño es más complicado y se encarece la producción.

Los objetivos se clasifican en tres tipos en orden ascendente de calidad: acromáticos, semiacromáticos y apocromáticos. Los apocromáticos tienen corrección de color para un mayor rango espectral. En el tipo de objetivos apocromáticos, Leica ofrece lentes especialmente diseñadas para igualar las especificaciones de exploración confocal (CS) de mayor calidad. La última serie CS2 ha mejorado más respecto a la serie CS anterior y la corrección de color lateral recién creada va de la mano con la innovadora óptica UV del Leica TCS SP8. La excelente corrección de color de los objetivos CS2 mejora la superposición del color, especialmente en la periferia de la imagen.

*Abreviaturas:

PL plano, corrección de la planitud del campo

APO apocromático, con corrección de color para el rango de longitudes de onda roja, azul y verde

Aquí encontrará una visión más general de los tipos de objetivos que ofrece Leica Microsystems.

Específico para la excitación a 355 nm: HC PL APO UVIS CS2

Con el HC PL APO 63x/1,20 W CORR UVIS CS2, ofrecemos un objetivo de gran ancho de banda específico para la excitación a 355 nm. Corrige muy bien el color desde 345-730 nm. Por este motivo, es perfecto para experimentos de fotoactivación, "uncaging" y fisiología mediante la obtención de imágenes ratiométricas y de línea Ca2+ única, el control de la expresión génica y la autofluorescencia.

Objetivos para la obtención de imágenes multifotónicas y CARS: HC PL IRAPO

Figura 4 La selección de objetivos IRAPO Infrarrojos-apocromáticos se corrige para el rango casi infrarrojo del espectro de longitud de onda. Por lo tanto, son ideales para imágenes multifotónicas, incluida la excitación con OPO, así como para CARS.

En el extremo opuesto del espectro de color ahora hay disponibles un nuevo conjunto de objetivos especializados para mejorar la obtención de imágenes multifotónicas (MP). Los nuevos apocromáticos IR (figura 4) corrigen el color hasta 1.300 nm y transmiten mucho en los rangos de longitud de onda visible e infrarrojo con > 85 % de transmisión desde 470 nm – 1.200 nm, por lo que son ideales para la obtención de imágenes no lineales, como la obtención de imágenes multifotónicas multicolores, que incluye la excitación con OPO (oscilador paramétrico óptico) y CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering). Consulte también la figura 5.

Figura 5 Visión general de varias correcciones de color para la microscopía confocal con distintos tipos de objetivo: CS2, UVIS CS2 y IR APO, respectivamente. Las respectivas correcciones de color de IRAPO, PL APO CS2 y PL APO UVIS CS2 se han diseñado para que tengan una compatibilidad óptima con aplicaciones específicas gracias a que garantizan una gran eficiencia de colocalización y detección en todo el campo de exploración. El gráfico muestra cómo los rangos óptimos (cuadros con líneas continuas) y los rangos útiles (cuadros con líneas discontinuas) se solapan para cubrir al completo el rango de longitud de onda de 355 nm a 1.300 nm. Para la zona verde punteada entre 405 nm y 450 nm existe corrección de color con algunos objetivos CS2. Al combinarse con la óptica de exploración óptima, se gana mucha flexibilidad aplicativa, gracias a que se dispone del objetivo adecuado para cada experimento.