Etiquetado de objetivos

Los objetivos Leica se codifican y etiquetan de forma diferente según su tipo.


Sistema HC de Leica Microsystems

El sistema Leica HC (Harmonic Compound System) comprende los componentes ópticos que se han combinado para crear imágenes óptimas y que participan en la corrección de aberraciones ópticas: objetivos, oculares, lentes de tubo, adaptadores para cámara y TV.

HC

El objetivo está incluido en el sistema HC.

HCX

El objetivo también es compatible con ópticas anteriores (óptica Delta 1991-1997)

 

El sistema HC garantiza

 

 

Para la corrección de ciertas aberraciones ópticas, el microscopio se considera un sistema completo.

La aberración esférica, la coma y la aberración cromática axial se corrigen mejor en el lugar en el que se originan, es decir, en el componente concreto.

La aberración cromática lateral y el astigmatismo se corrigen en paralelo en el objetivo, la lente de tubo y el ocular.

Por tanto, el resultado óptimo de la imagen se obtiene mediante la combinación de correcciones.


Clases de objetivos

Los objetivos se etiquetan según su categoría.

Acromáticos

Semiapocromáticos

Apocromáticos

HI PLAN
N PLAN
FL PLAN
PL Fluotar
PL S-Apo

PL APO
PL APO CS / CS2
PL IRAPO

 

Se pueden encontrar más detalles sobre nuestras clases de objetivos en otra sección.


Aumento del objetivo

Cada objetivo está etiquetado con su aumento, por ejemplo 5x o 100x. sin embargo, el aumento del objetivo no determina por sí solo el aumento general del microscopio, sino que se obtiene a partir del aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular (para lentes de tubo 1x).

Ejemplo:

objetivo 40x x oculares 10x = 400x de aumento total.

Sin embargo, hay que mencionar que cuanto mayor sea el aumento del objetivo, menor será el campo visible del objeto. ;





Distancia de trabajo extralarga

La zona accesible de la muestra suele estar restringida por colisiones del objetivo con el portamuestras, los bordes de una placa multipocillo o el equipo adicional, por ejemplo, en la adquisición de imágenes intravitales o para electrofisiología. Los objetivos con una distancia de trabajo extralarga permiten también adquirir imágenes de los bordes de dichas muestras sin restricciones.

La adquisición de imágenes de tejidos profundos por excitación multifotónica o en tejidos clarificados también requiere objetivos con una distancia de trabajo extralarga para poder aprovechar completamente las ventajas ópticas de esas técnicas. De ahí que la necesidad de distancias de trabajo de más de un milímetro sea algo bastante común. Sin embargo, la apertura numérica del objetivo aún tiene que ser lo más grande posible para que las imágenes tengan una alta resolución.

Leica Microsystems ofrece una gama de objetivos secos o para inmersión en agua con una distancia de trabajo excepcionalmente larga. También están disponibles los objetivos de inmersión en agua con distancias de trabajo extralargas que presentan un gran ángulo de acceso y un frontal de cerámica inerte con conductividad eléctrica y térmica mínima para aplicaciones de electrofisiología.

Objetivos de inmersión en agua con distancias de trabajo extralargas:

HCX APO L 20x/1 W con montura M32 para utilizar con Leica DM6000 FS y CFS, FWD: 2 mm
HCX IRAPO L 25x/0,95 W con montura M25 para utilizar con todos los microscopios, FWD: 2,5 mm
HCX APO serie L U-V-I, FWD: 2,2 – 3,6 mm

L = Objetivo con distancia de trabajo extralarga


Plano retrofocal

Los objetivos Leica Microsystems están definidos por planos retrofocales fijos (ver ilustración).

El código del plano retrofocal del objetivo sirve como referencia para seleccionar el prisma DIC del objetivo correspondiente en caso necesario. Esto tiene la ventaja de que se pueden utilizar varios objetivos con un solo prisma DIC.

A, B, C, D o E = Plano retrofocal del objetivo


Cubreobjetos adecuados

El cubreobjetos es un componente importante de la trayectoria óptica y, por tanto, debería cumplir los mismos estándares de calidad óptica que el objetivo. Los objetivos de alta calidad sólo pueden ofrecer todo su potencial si se utilizan un medio de inmersión y cubreobjetos corregidos.

Los objetivos secos, de agua y de glicerol son extremadamente sensibles a las desviaciones de grosor del cubreobjetos. Se pueden utilizar objetivos con un collar de corrección para corregir estas desviaciones.

-

para su uso con y sin cubreobjetos

0

para su uso con y sin cubreobjetos

0,17

para su uso con un cubreobjetos de 0,17 mm (DIN/ISO)

1,8 Q

para su uso con ventanas de cristal de cuarzo de 1,8 mm sobre platinas térmicas

0-2

para su uso con cubreobjetos de cristal de 0-2 mm de grosor

 

Los grosores estándar de cubreobjetos de cristal disponibles son:

N.º 1

0,13 mm-0,17 mm

N.º 1,5

0,16 mm-0,19 mm

N.º 1.5H

0,17 mm +/-0,005 mm

 

El tipo de cubreobjetos que se requiere para lograr un resultado óptimo depende del medio de inmersión y de la apertura numérica (NA): Se puede seguir la Tabla 1 como regla general.

Tabla 1: Cubreobjetos y líquidos de inmersión

Medio de inmersiónCon o sin
cubreobjetos
Cubreobjetos tipo
1.5

Cubreobjetos tipo
1.5 H

AireNA 0,30NA 0,70NA 0,70
AguaNA 0,60NA 0,90NA 0,90
Tipo de inmersión G (glicerol)NA 0,80NA 1,10NA 1,10
Tipo de inmersión N (aceite)NA 0,90NA 1,30-
Tipo de inmersión F (aceite)NA 0,90NA 1,30NA 1,30

 

 


Métodos de contraste

Los métodos de contraste hacen visibles los cambios de fase que de otro modo son invisibles para el ojo humano, lo que permite la observación de muestras vivas no coloreadas.

Los objetivos especialmente adecuados para métodos de contraste específicos están etiquetados en consecuencia.

BD

para campo claro/campo oscuro de episcopía

PH

objetivo de contraste de fases

RC

objetivo de contraste de reflexión (sólo con DM R)

P, POL

baja tensión, para polarización cuantitativa

/

no adecuado para episcopía, excepto fluorescencia

LMC

objetivo de contraste de modulación (solo con Leica DM IRB)


Medios de inmersión para objetivos

Para una alta potencia de resolución, la apertura numérica (NA) de un objetivo debe ser mayor de 1. Esto también requiere un medio de inmersión con un índice de refracción mayor de 1, es decir, que no sea el aire. Los medios de inmersión comunes son aceite, agua y glicerol. El medio de inmersión que debe utilizarse con cada objetivo concreto se indica en el objetivo.

ACEITE

Aceite de inmersión estándar DIN/ISO

W

Agua

GLYC

Glicerol

IMM

Cualquier otro o más de un medio de inmersión

 

 

Todos los elementos con relevancia óptica (medio de inmersión, cristal, cubreobjetos, muestra) que se colocan delante de la lente frontal del objetivo tienen una influencia importante en la calidad de la imagen. Lo ideal sería que el índice de refracción de todas estas capas ópticas coincidieran con los índices de refracción para los que fue diseñado el objetivo. En realidad, esto es casi imposible ya que con frecuencia las muestras no son homogéneas, el grosor del cubreobjetos no es tan preciso y durante la adquisición de la imagen tienen lugar cambios de temperatura. Estos factores deben tenerse en cuenta al escoger un objetivo y un medio de inmersión para una aplicación concreta.

Índices de refracción de algunos medios de inmersión importantes

Cultivos de células

1,33 - 1,38

Tipo de aceite F

1,52

Glicerol

1,45 (21 °C) - 1,46 (37 °C) para líquido de inmersión Leica tipo G

Aceite de silicona

1,41

Agua

1,33

100 % PBS pH 8,9

1,34

Mowiol

1,46

Bálsamo de Canadá

1,52

Cubreobjetos

1,52

 

Cuanto mayor sea la apertura numérica del objetivo y más profundas las estructuras de interés dentro de la muestra, más importante es que coincidan los índices de refracción de la muestra y el medio de inmersión. Las diferencias en los índices de refracción provocan aberraciones esféricas y distorsiones geométricas de las estructuras. El resultado es una pérdida de contraste y definición, así como estructuras que parecen comprimidas o alargadas.

Aceite

 

 

El índice de refracción del aceite de inmersión Leica de tipo N y tipo F es 1,518 (a 23 ºC y 546 nm), es decir, el mismo que el vidrio sosa (n=1,518). Para la adquisición de imágenes multicolor también es importante la dispersión del aceite de inmersión. A esto se le suele llamar número Abbe y debe coincidir con el número Abbe para el que fue diseñado el objetivo porque, si no es así, aparecen aberraciones cromáticas. Por ejemplo, el aceite de inmersión Leica de tipo N tiene un número Abbe de 42,1, mientras que el aceite de inmersión tipo F tiene un número Abbe de 46, óptimo para la adquisición de imágenes de fluorescencia. El tipo N no es adecuado para la adquisición de imágenes de fluorescencia.

Los objetivos de inmersión en aceite son ideales para las muestras que están en un medio que coincide con el índice de refracción del aceite, es decir, muestras fijas clásicas embebidas en resina, bálsamo de Canadá o glicerol-gelatina, o que se adquieren cerca del cubreobjetos, es decir, a menos de unos pocos µm. Lejos del cubreobjetos, el brillo y la resolución de la imagen se deteriora rápidamente si los índices de refracción no coinciden.

Para la adquisición de imágenes de células vivas, es decir, en una muestra acuosa, recomendamos encarecidamente el uso de inmersión en agua o glicerol.

Los objetivos de inmersión en aceite con aperturas extremadamente elevadas solo ofrecen un rendimiento óptico completo en un intervalo de temperatura relativamente pequeño, ya que el índice de refracción del aceite de inmersión depende en gran medida de la temperatura. Cuanto más larga es la distancia de trabajo, más gruesa es la capa de aceite, y por tanto, mayor es el impacto de las aberraciones relacionadas con la temperatura sobre la calidad de la imagen. Este efecto de temperatura cambia linealmente con la distancia de trabajo, pero depende de la apertura numérica elevada a la cuarta potencia.

Para experimentos a temperaturas distintas a la temperatura ambiente, se recomienda la inmersión en agua, ya que el índice de refracción del agua depende considerablemente menos de la temperatura y se puede compensar, porque muchos objetivos de inmersión en agua tienen collares de corrección.

Agua

 

 

Los objetivos de inmersión en agua son perfectos para observar células vivas en medios acuosos, ya que el índice de refracción del medio de inmersión y el de la muestra son más parecidos que, por ejemplo, con aceite de inmersión. Sin embargo, el agua se evapora rápidamente a 37 °C. El microdispensador de inmersión en agua de Leica añade agua automáticamente durante un experimento en curso para una inmersión en agua estable.

Glicerol

 

 

Actualmente, la mayoría de las muestras fijas como cultivos de células, cortes de tejidos de muestras gruesas o embriones completos, se montan en Mowiol, Vectashield o mezclas similares que contienen agua y glicerol, además de diversas sustancias químicas, por ejemplo, antidecolorantes y sustancias de conservación. Estos medios tienen índices de refracción cercanos a los de una mezcla de 80 % de glicerol y 20 % de agua (n=1,45). Los objetivos de glicerol son excelentes para las muestras montadas en cualquier medio con un índice de refracción cercano a 1,45 – 1,46.

Los objetivos de glicerol de Leica ofrecen un collar de corrección para ajustar la óptica a los diversos índices de refracción que ocurren con los cambios de composición del medio de montaje o con las variaciones del grosor y la temperatura del cubreobjetos. En la Application Letter n.º. 17 (Ábrigo 2004) se muestra una detallada descripción de los objetivos de glicerol y los efectos de las discordancias entre índices de refracción.

Objetivo para inmersión en glicerol:

HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2


La mayoría de objetivos multiinmersión (IMM) se pueden utilizar tanto para glicerol como para aceite de inmersión, tal y como se describe más adelante.

Multiinmersión

 

 

Los objetivos adecuados para utilizar con múltiples líquidos de inmersión, es decir, aceite, agua y glicerol, se pueden utilizar con el medio de inmersión óptimo para una amplia variedad de muestras.

Objetivos multiinmersión:

HC PL APO 10x/0,40 IMM CS
HC PL APO 20x/0,75 IMM CS2


Número de pedido

El objetivo lleva un código de 6 dígitos y se necesita para solicitarlo a Leica Microsystems.

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