Medios de inmersión para objetivos

Para una alta potencia de resolución, la apertura numérica (NA) de un objetivo debe ser mayor de 1. Esto también requiere un medio de inmersión con un índice de refracción mayor de 1, es decir, que no sea el aire. Los medios de inmersión comunes son aceite, agua y glicerol. El medio de inmersión que debe utilizarse con cada objetivo concreto se indica en el objetivo.

ACEITE

Aceite de inmersión estándar DIN/ISO

W

Agua

GLYC

Glicerol

IMM

Cualquier otro o más de un medio de inmersión

 

 

Todos los elementos con relevancia óptica (medio de inmersión, cristal, cubreobjetos, muestra) que se colocan delante de la lente frontal del objetivo tienen una influencia importante en la calidad de la imagen. Lo ideal sería que el índice de refracción de todas estas capas ópticas coincidieran con los índices de refracción para los que fue diseñado el objetivo. En realidad, esto es casi imposible ya que con frecuencia las muestras no son homogéneas, el grosor del cubreobjetos no es tan preciso y durante la adquisición de la imagen tienen lugar cambios de temperatura. Estos factores deben tenerse en cuenta al escoger un objetivo y un medio de inmersión para una aplicación concreta.

Índices de refracción de algunos medios de inmersión importantes

Cultivos de células

1,33 - 1,38

Tipo de aceite F

1,52

Glicerol

1,45 (21 °C) - 1,46 (37 °C) para líquido de inmersión Leica tipo G

Aceite de silicona

1,41

Agua

1,33

100 % PBS pH 8,9

1,34

Mowiol

1,46

Bálsamo de Canadá

1,52

Cubreobjetos

1,52

 

Cuanto mayor sea la apertura numérica del objetivo y más profundas las estructuras de interés dentro de la muestra, más importante es que coincidan los índices de refracción de la muestra y el medio de inmersión. Las diferencias en los índices de refracción provocan aberraciones esféricas y distorsiones geométricas de las estructuras. El resultado es una pérdida de contraste y definición, así como estructuras que parecen comprimidas o alargadas.

Aceite

 

 

El índice de refracción del aceite de inmersión Leica de tipo N y tipo F es 1,518 (a 23 ºC y 546 nm), es decir, el mismo que el vidrio sosa (n=1,518). Para la adquisición de imágenes multicolor también es importante la dispersión del aceite de inmersión. A esto se le suele llamar número Abbe y debe coincidir con el número Abbe para el que fue diseñado el objetivo porque, si no es así, aparecen aberraciones cromáticas. Por ejemplo, el aceite de inmersión Leica de tipo N tiene un número Abbe de 42,1, mientras que el aceite de inmersión tipo F tiene un número Abbe de 46, óptimo para la adquisición de imágenes de fluorescencia. El tipo N no es adecuado para la adquisición de imágenes de fluorescencia.

Los objetivos de inmersión en aceite son ideales para las muestras que están en un medio que coincide con el índice de refracción del aceite, es decir, muestras fijas clásicas embebidas en resina, bálsamo de Canadá o glicerol-gelatina, o que se adquieren cerca del cubreobjetos, es decir, a menos de unos pocos µm. Lejos del cubreobjetos, el brillo y la resolución de la imagen se deteriora rápidamente si los índices de refracción no coinciden.

Para la adquisición de imágenes de células vivas, es decir, en una muestra acuosa, recomendamos encarecidamente el uso de inmersión en agua o glicerol.

Los objetivos de inmersión en aceite con aperturas extremadamente elevadas solo ofrecen un rendimiento óptico completo en un intervalo de temperatura relativamente pequeño, ya que el índice de refracción del aceite de inmersión depende en gran medida de la temperatura. Cuanto más larga es la distancia de trabajo, más gruesa es la capa de aceite, y por tanto, mayor es el impacto de las aberraciones relacionadas con la temperatura sobre la calidad de la imagen. Este efecto de temperatura cambia linealmente con la distancia de trabajo, pero depende de la apertura numérica elevada a la cuarta potencia.

Para experimentos a temperaturas distintas a la temperatura ambiente, se recomienda la inmersión en agua, ya que el índice de refracción del agua depende considerablemente menos de la temperatura y se puede compensar, porque muchos objetivos de inmersión en agua tienen collares de corrección.

Agua

 

 

Los objetivos de inmersión en agua son perfectos para observar células vivas en medios acuosos, ya que el índice de refracción del medio de inmersión y el de la muestra son más parecidos que, por ejemplo, con aceite de inmersión. Sin embargo, el agua se evapora rápidamente a 37 °C. El microdispensador de inmersión en agua de Leica añade agua automáticamente durante un experimento en curso para una inmersión en agua estable.

Glicerol

 

 

Actualmente, la mayoría de las muestras fijas como cultivos de células, cortes de tejidos de muestras gruesas o embriones completos, se montan en Mowiol, Vectashield o mezclas similares que contienen agua y glicerol, además de diversas sustancias químicas, por ejemplo, antidecolorantes y sustancias de conservación. Estos medios tienen índices de refracción cercanos a los de una mezcla de 80 % de glicerol y 20 % de agua (n=1,45). Los objetivos de glicerol son excelentes para las muestras montadas en cualquier medio con un índice de refracción cercano a 1,45 – 1,46.

Los objetivos de glicerol de Leica ofrecen un collar de corrección para ajustar la óptica a los diversos índices de refracción que ocurren con los cambios de composición del medio de montaje o con las variaciones del grosor y la temperatura del cubreobjetos. En la Application Letter n.º. 17 (Ábrigo 2004) se muestra una detallada descripción de los objetivos de glicerol y los efectos de las discordancias entre índices de refracción.

Objetivo para inmersión en glicerol:

HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2


La mayoría de objetivos multiinmersión (IMM) se pueden utilizar tanto para glicerol como para aceite de inmersión, tal y como se describe más adelante.

Multiinmersión

 

 

Los objetivos adecuados para utilizar con múltiples líquidos de inmersión, es decir, aceite, agua y glicerol, se pueden utilizar con el medio de inmersión óptimo para una amplia variedad de muestras.

Objetivos multiinmersión:

HC PL APO 10x/0,40 IMM CS
HC PL APO 20x/0,75 IMM CS2