La méthode de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

La FCS est une méthode basée sur la mesure de l'intensité de fluorescence. Les molécules fluorescentes traversant un faisceau laser focalisé sont excitées afin d'engendrer une émission de fluorescence. Après avoir traversé un diaphragme confocale, les photons émis sont enregistrés à l'aide de détecteurs sensibles.

Les mesures de la FCS sont effectuées avec le système Leica TCS SP8 SMD.


Paramètres quantitatifs dérivés de la courbe d'auto-corrélation

Les particules en mouvement donnent lieu à des variations d'intensité. Une auto-corrélation révèle des informations à l'échelle moléculaire : l'amplitude de la courbe de corrélation montre le nombre de particules. Les données au point d'inflexion contiennent les informations sur la mobilité de la particule. Enfin, l'inclinaison et la forme de la courbe reflètent le type de diffusion. La concentration, la masse et la viscosité de la particule, ainsi que la fraction libre, peuvent dériver de ces paramètres.

Les principes de l'analyse et de l'acquisition des données FLIM

 

  1. Éclairage à laser sur un point focal (beam parking) afin d'exciter les particules fluorescentes dans le volume d'excitation. Le mouvement de particules vers et en dehors du volume confocal cause des fluctuations d'intensité.
  2. L'inscription des fluctuations d'intensité utilisant les détecteurs dans un mode de comptage de photons unique.
  3. Calcul de la fonction de corrélation
  4. Adapter le modèle biophysique correspondant à la courbe de corrélation Obtenir des paramètres d'intérêt :

    • concentration de la particule
    • coefficient de diffusion
    • viscosité
    • masse moléculaire
    • constante de fixation
    • propriétés photo-physiques

1. Laser illumination at a fixed point of interest (beam parking) excites fluorescent particles in the excitation volume. The particle movement in and out of the confocal volume causes intensity fluctuations.
3. Calculation of the correlation function<br>4. Fitting of the corresponding biophysical model