FLIM FRET– La méthode

FLIM-FRET : La règle moléculaire

 

Une application typique du FLIM est le FLIM-FRET. FRET est une technique bien établie servant à étudier les interactions moléculaires. Elle examine la liaison aux protéines et estime également les distances intermoléculaires sur une échelle Angström. Le système Leica TCS SP8 SMD conjointement avec les outils d'analyse FRET dans le logiciel SymPhoTime de PicoQuant fournit une base solide pour effectuer des études de haute qualité.


L'effet du FRET

Dans une expérimentation FRET, les partenaires de liaison potentiels sont étiquetés avec des fluorophores de spectre différent, si bien que le spectre de l'émission de la molécule donneuse chevauche le spectre d'excitation de la molécule accepteur.

Si les deux partenaires interactifs sont en contact rapproché à seulement quelques nanomètres, le donneur en état d'excitation peut transférer son énergie à l'accepteur. À tour de rôle, l'accepteur émet un photon fluorescent avec la diminution de la durée de vie de fluorescence de la molécule donneuse.

L'intérêt du FLIM-FRET

 

Les méthodes FRET basées sur l'intensité sont assez susceptibles aux variations dans le niveau d'expression ou la diffusion de la molécule inhérente à l'échantillon. Ceci s'applique également à des influences externes telles que le mouvement de l'échantillon et la fluctuation de l'excitation.

À cet effet, FLIM-FRET est particulièrement avantageux, car il est calibré de l'intérieur. Il permet des mesures FRET d'avoir lieu indépendamment de telles perturbations. Si FRET agit, une diminution de la vie du donneur est observée. Cette valeur est une mesure de l'efficacité de FRET.

L'association de FLIM-FRET et SP FLIM peut être utilisée pour améliorer la qualité des données et affiner la précision des données quantitatives.

Donneur et accepteur sont séparés par une distance r >>R<sub>0</sub>
Sur une distance réduite r~R<sub>0</sub> le FRET donne naissance à un accepteur de fluorescence