FLIM sont menées avec le Leica TCS SP8 SMD avec la configuration FLIM.

Microscopie de temps de vie de fluorescence

 

Le temps de vie de fluorescence permet de mesurer la durée de vie moyenne du fluorophore dans son état d'excitation avant de retourner en état non-excité en émettant un photon de fluorescence. L'émission de la fluorescence émise par les atomes à partir d'un fluorophore ne s'effectue pas à des moments fixes. Au contraire, des temps de distribution sont respectés pouvant être décrits par une fonction de désintégration exponentielle. Les caractéristiques des constantes de temps de cette désintégration, la durée de vie de fluorescence, vont de quelques picosecondes (10-12 s) à plusieurs dizaines de nanosecondes(10-9 s).

La durée de vie de fluorescence en tant que sonde pour le nano-environnement 

 

Cette durée de vie est une caractéristique de chaque colorant de fluorescence qui peut varier avec son micro-entourage ou son état de conformation. Les informations de durée de vie sondent l'environnement moléculaire pour sa composition, telle que la concentration d'ion, le pH, la lipophilicité ou les liaisons avec d'autres molécules.

Association de la mesure de la durée de vie et de l'imagerie

 

FLIM associe des mesures de la durée de vie à l'imagerie : les durées de vie obtenues au niveau du pixel sont à code couleur pour produire des images. Ainsi, le FLIM offre des informations concernant la distribution spatiale de la molécule fluorescente avec des informations concernant son nano-environnement. De cette façon, une dimension supplémentaire de l'information est obtenue.

Les principes de l'analyse et de l'acquisition des données FLIM

 

  1. Les mesures répétées du laps de temps entre une impulsion laser et fluorescence émise par les atomes pour chaque pixel.
  2. Calcul de l'histogramme du comptage de photons à l'heure d'arrivée après l'impulsion laser.
  3. Adapte une décroissance exponentielle à chaque histogramme. L'amplitude reflète le nombre total de photons, la constante de temps τ appelée durée de vie de fluorescence.
  4. Affichage de la durée de vie de l'image à l'aide d'une table de recherche en fausses couleurs.
Acquisition et analyse des données FLIM, étape 1
étape 4