Diviseurs de faisceaux

L'un des défis majeurs rencontrés en microscopie de fluorescence et en microscopie confocale est celui de la séparation de la lumière d'excitation d'un laser par exemple, et la séparation de la lumière de fluorescence de l'échantillon. La lumière d'excitation doit traverser l'échantillon librement, sans que rien ne contamine le signal de fluorescence qui est nettement plus faible d'un facteur de 10-5 (voir Figure 1). À titre de comparaison, ce ratio s'apparente aux intensités de lumière d'une petite bougie contre celles de vingt lampes halogènes de 1 000 W. Pour la garantie d'une détection de la lumière de fluorescence sans contamination de la part de la lumière d'excitation, le diviseur de faisceau constitue un élément crucial et assure le contraste d'image sur le trajet optique. Pour consulter une présentation globale des différents types de diviseurs de faisceaux, veuillez vous rendre sur le Leica Science Lab où vous pourrez trouver l'article correspondant écrit par Rolf Borlinghaus. Il passe en revue les types de diviseurs de faisceaux utilisés dans le Leica TCS SP8.

Figure 1 : Diviseur de faisceau en microscopie de fluorescence La lumière d'excitation (flèche bleue) est couplée dans le chemin de la lumière à l'aide d'un miroir dichroïque, puis transférée vers l'échantillon. Une partie de la lumière est réfléchie sur le diviseur de faisceau où elle est ensuite bloquée. La majorité excite la fluorescence (flèche discontinue rouge) qui traverse le diviseur de faisceau pour pouvoir être détectée. Remarquez l'énorme différence d'intensité entre la lumière d'excitation et la lumière d'émission, qui est de cinq ordres de grandeur.


LIAchroics

Les LIAchroics sont des modèles de diviseurs de faisceaux dichroïques plus avancés. Ces derniers se comportent comme des miroirs semi-transparents sélecteurs de longueur d'onde, par ex. la lumière bleue est réfléchie, mais la lumière verte peut traverser. Cela signifie que les miroirs dichroïques, comme ils sont parfois appelés, sont sélectionnés selon le déplacement de Stokes d'un colorant fluorescent. Les propriétés spectrales spécifiques à un diviseur de faisceau sont déterminées par une fine couche de revêtements optiques sur un substrat de verre. Les diviseurs de faisceaux dichroïques sont des filtres d'interférence. Le revêtement est fixé, ce qui signifie qu'un diviseur de faisceau dédié est requis pour chaque combinaison de laser/colorant. Pour cela, on place un ensemble de filtres sur une glissière ou un disque amovible de sorte à pouvoir les positionner sur le trajet optique au besoin. Comme le montre la Figure 1, le concept traditionnel utilise un angle à 45° pour le miroir dichroïque, ce qui présente des avantages pour la séparation géométrique des lumières d'excitation et d'émission, les faisceaux étant orthogonaux. Cependant, ce concept n'offre pas la même permissivité à tous les angles de lumière polarisée (de façon linéaire). Par conséquent, une partie de la lumière de fluorescence est perdue, son plan de polarisation étant « mal » orienté. On explique ceci par « l'angle de Brewster ». La transmission ou la réflexion de la lumière sur une interface air-verre est déterminée par son angle d'incidence. Pour des interfaces air-verre, l'angle de Brewster est d'environ 56° – trop proche des 45° typiques des miroirs dichroïques. De jolies visualisations d'interfaces air-verre par Srihari Angaluri et Kiril Vidimce sont consultables ici. Lorsque l'angle de la lumière incidente est largement inférieur à 45°, cet effet est éliminé. C'est pourquoi, comparés aux précédents modèles de diviseurs de faisceaux, les diviseurs de faisceaux LIAchroic, ou dichroïques épiscopiques faibles, offrent un contraste et une sensibilité améliorés. Les diviseurs de faisceau LIAchroics sont élaborés sur mesure et fabriqués par Leica pour garantir une division de faisceau aussi efficace qu'économique.

AOBS

En dépit des récentes avancées observées dans la production de miroirs dichroïques, deux handicaps survivent : En tant que filtres, ils continuent de perdre une certaine lumière de fluorescence et leur confinement à certaines longueurs d'onde limite la flexibilité de l'instrument confocal. Pour les miroirs dichroïques, la perte de lumière est non seulement due à une transmission inférieure à 100 % au-dessus de la longueur d'onde de division, mais aussi due aux caractéristiques de filtre voisines de cette longueur d'onde. Les diviseurs de faisceaux dichroïques suppriment en général une bande d'environ 20 nm de largeur autour de la longueur d'onde du laser. Cette région spectrale contenant souvent l'émission maximum du spectrum d'un colorant, une perte de lumière se produira (voir Figure 2, zone jaune supérieure).

Figure 2 : Caractéristiques de filtre d'un ancien diviseur de faisceau double dichroïque comparé à l'AOBS Une bande spectrale autour de la longueur d'onde nominale du filtre est supprimée (blanc vs bleu clair). La lumière de fluorescence traversant le filtre est détectée (bleu foncé/vert), et une certaine lumière est perdue (jaune). En raison de sa coupure droite, l'AOBS ne souffre que très peu de cette problématique inhérente aux diviseurs de faisceaux dichroïques.

En réponse à ce dilemme, il est possible d'avoir recours à un concept de division de faisceau sans filtre. Avec le diviseur de faisceau acousto-optique (AOBS), Leica introduit une technologie de division de faisceau agissant comme multiplexeur pour plusieurs longueurs d'onde simultanément (Figure 3).

Figure 3 : Diviseur de faisceau acousto-optique (AOBS) Un cristal fabriqué avec l'homologue du quartz, le dioxyde de tellure (TeO2) agit comme déflecteur de longueur d'onde. Ainsi, une onde acoustique de très basse fréquence est couplée au cristal, modifiant ainsi ses propriétés de dispersion. Ce principe peut être appliqué à un maximum de huit longueurs d'onde à la fois, grâce à la superposition de plusieurs fréquences acoustiques. Le principe physique sous-jacent est basé sur les déformations du réseau cristallin, y compris ses électrons. Ils interagissent avec le champ électrique de la lumière incidente, la guidant différemment selon le déplacement respectif de l'électron.


En pratique, et particulièrement en imagerie multispectrale, la coupure droite de l'AOBS procure une division de faisceau plus efficace, car elle permet de détecter davantage de lumière (Figure 4). De plus, l'utilisation de miroirs dichroïques empêche l'enregistrement simultané de certaines combinaisons de colorants, notamment la triple combinaison GFP; YFP et mCherry. Une telle combinaison de filtre n'existant pas, il est impossible d'obtenir une flexibilité expérimentale totale permettant de combiner à souhait tout type de marqueur fluorescent (Figure 5A). Encore une fois, la coupure droite de l'AOBS aide à répondre à cette problématique en permettant l'enregistrement parallèle de bandes d'émission très étroites, avec le soutien du système de détection sensible du Leica TCS SP8 (Figure 5B). Vous trouverez ici un exemple de cellule vivante d'enregistrement simultané GFP, YFP et mCherry. Encore plus de combinaisons sont possibles, l'AOBS pouvant être reprogrammé sur une longueur d'onde différente en quelques microsecondes, et même diviser simultanément jusqu'à 8 lignes laser. Ainsi, le balayage à séquence de lignes procure un enregistrement multicanal pseudo-simultané en plus des enregistrements simultanés décrits ci-dessus. Par contraste, le balayage séquentiel n'est pas possible sur toutes les combinaisons de filtres dichroïques. Ces propriétés rendent l'AOBS idéal pour les installations multilaser où 8! = 40 320 des combinaisons différentes sont possibles. Ceci s'applique d'autant plus aux lasers à lumière blanche (WLL2) permettant quelques milliards de combinaisons d'excitation, et une microscopie confocale blanche entièrement ajustable.

Figure 4 : Rendement lumineux de l'AOBS Rangée supérieure : spectrums d'excitation (lignes pointillées) et d'émission (lignes solides) dans des échantillons multicolores avec Cy2 (vert), Cy3 (jaune) et Cy5 (rouge), respectivement. Les remplissages représentent la fluorescence transmise à > 90 % de transmission des diviseurs de faisceaux dichroïques (A) et de l'AOBS (B). La fluorescence détectable est intégrée et exprimée par rapport au spectre d'émission intégré du colorant respectif (C). L'AOBS transmet une plus grande partie de la lumière de fluorescence (C, barres rouges) que les dichroïques (C, barres bleues).

 

Figure 5 : Flexibilité et rapidité grâce à l'AOBS Les spectrums GFP, YPF et mCherry sont représentés respectivement en vert, jaune et rouge sur la Figure 4. Aucune combinaison de miroirs dichroïques ne permet d'enregistrer simultanément les spectrums d'émission GFP et YFP superposés. La superposition de bandes de longueurs d'onde dichroïques typiques est représentée en pointillés, ce qui ne laisse aucun espace à l'excitation 514 nm. Par contraste, l'AOBS capture les deux spectrums en parallèle grâce à des bandes de détection étroites utilisées en conjonction avec le détecteur SP et, en option, les HyD.

Exemple de cellule vivante