Lasers de microscopie confocale

Depuis son apparition, la microscopie confocale a toujours requis des sources lumineuses à forte luminosité et un faisceau pouvant être facilement mis au point dans un point à diffraction limitée. L'outil le mieux adapté pour répondre à ces critères est le laser (acronyme anglais pour Light Amplification by Simulated Emission of Light). C'est pourquoi les microscopes confocaux actuellement disponibles sur le commerce utilisent tous le laser comme source lumineuse.

En termes de réalisation technique, on discerne plusieurs types de lasers. Les classes les plus notables sont les lasers semi-conducteurs, lasers à l'état solide, lasers à gaz et lasers à fibre. Par mesure de simplicité, nous considérerons les lasers semi-conducteurs comme des lasers à l'état solide. Leica emploie chacun de ces types de laser, en fonction des exigences de l'application. En voici un aperçu, avec des liens vers des informations supplémentaires.


Principes généraux

 

Le principe sous-jacent commun à tous les lasers est celui de l'émission stimulée. Ce terme fait référence à un type d'émission « forcée », par ex. la lumière, par opposition à l'émission spontanée qui constitue la base de la fluorescence. L'émission stimulée exige
la (sur-)population d'un état quantique excité à partir duquel l'émission stimulée peut se produire. Dans des conditions normales de distribution Boltzmann entre l'état fondamental et l'état excité, l'émission stimulée est un processus extrêmement rare. Ainsi, les lasers exigent une inversion de la population d'équilibre, c'est-à-dire que l'état excité doit être plus populé que l'état fondamental. Pour atteindre cette distribution hors équilibre, l'énergie est transférée depuis un niveau d'énergie couplé supérieur, par ex. dans un autre matériau. Ce processus est connu sous le nom de pompage. Selon la marque de fabrique du laser, le pompage peut être effectué par la lumière (pompage optique) ou par un champ électrique. Les photons émis entraînent une émission supplémentaire provoquant une auto-amplification. C'est pourquoi les lasers tendent à produire une lumière cohérente (la lumière étant en phase, car émise simultanément). Notons également que l'émission stimulée est aussi le principe sous-jacent de la déplétion par émission stimulée (STED) appliquée en microscopie de super-résolution. Une présentation générale des lasers utilisés en microscopie confocale peut être consultée sur le Leica Science Lab.

Lasers à solides

 

Par définition, le milieu amplifiant (également connu sous le nom de milieu actif) d'un laser à solides est un solide (par opposition à un gaz, par exemple). Les lasers à solides sont aujourd'hui reconnus comme modèle de laser à part entière. Le premier laser, élaboré par Theodore Maiman en 1960, utilisait d'ailleurs un rubis pompé de manière optique comme matériau laser. Si le pompage est effectué de façon électrique dans un semi-conducteur, le laser est alors appelé laser à diodes. Si le pompage est effectué au moyen de la lumière (pompage optique), on l'appelle laser à pompage optique ou laser à solides pompé par des diodes.

Il existe une vaste gamme de lasers à diodes disponibles à prix raisonnable, ce qui en fait des lasers idéaux pour l'imagerie confocale d'entrée de gamme. Plusieurs lasers à solides sont utilisés dans le Leica TCS SP8. Ils offrent une grande stabilité, produisent peu de chaleur et ne requièrent donc aucun refroidissement. L'unité d'alimentation compacte du Leica TCS SP8 contient différents lasers à diodes et lasers à solides à pompage optique et est peu encombrante. L'unité d'alimentation flexible permet quant à elle de combiner des lasers à gaz et des lasers à solides à pompage optique, mais elle requiert davantage d'espace et un meilleur système de refroidissement.

Laser à l'état solide pour des longueurs d'onde supérieures à 680 nm

 

À l'autre bout de l'échelle, tant en termes techniques que de longueurs d'onde, les lasers infrarouges à impulsion femtoseconde, tels que les lasers titane-saphir utilisant des cristaux de saphir dopé avec du titane comme matériau laser (voir une photographie sur Wikipedia). Grâce à leur longueur d'onde d'émission ajustable entre 680 et 1 050 nm, ils sont utilisés en imagerie tissulaire multiphotons à plus grande profondeur, la dispersion des grandes longueurs d'onde étant réduite. Les lasers titane-saphir sont également utilisés en photo activation et microdissection laser.

Une version spéciale, l'oscillateur paramétrique optique (OPO), étend la longueur d'onde à 1 300 nm et plus. Ce n'est pas un laser en soi, mais il nécessite un laser (généralement un laser titane-saphir) agissant comme laser de pompage. En microscopie multiphotons, il est utilisé pour l'excitation de protéines fluorescentes rouges ou dans le cadre d'applications spécifiques (par ex. CARS) produisant un contraste chimique.

Les lasers titane-saphir et OPO sont des lasers à impulsion, dont les longueurs d'impulsion sont d'environ 70-200 fs. Ceci permet de garantir des pics de puissance suffisamment élevés pour produire des effets multiphotons, tout en conservant la puissance moyenne suffisamment faible pour préserver la viabilité cellulaire.

Des informations complémentaires sur les lasers infrarouges et leurs applications sont consultables au travers des articles Science Lab suivants :

  • Imagerie des tissus profonds avec MP et OPO par Julien Vermot et Andrea Pfeifer

 

  • Qu'est-ce qu'un OPO ? par Bernd Sägmüller et Andrea Pfeifer

 

  • CARS et le confocal par Stefanie Degenhartt et Vanessa Lurquin

 

  • Neurobiologie avec imagerie multiphotons par Randy Bruno et Myriam Gastard

 

  • Recherche originale sur la formation osseuse à l'aide de la génération harmonique secondaire par Scaglione et al.

 

  • Photo activation de PA-GFP à l'aide de la microscopie multiphotons par Diaspro et al.

Lasers à gaz

 

Ici, le matériau laser est une cavité remplie de gaz. En raison de la nature même des transitions d'énergie atomique, les lignes laser produites par un laser à gaz sont particulièrement monochromatiques et procurent ainsi le meilleur contraste d'image parmi les lasers à onde continue.. Certains gaz, notamment le mélange d'argon et de krypton, possèdent plusieurs niveaux d'énergie pouvant être lasés simultanément, et procurent une source multiligne de 458 à 514 nm. Dans le cas du laser à argon, le gaz est transformé en plasma, c'est-à-dire un gaz surchauffé et ionisé avec conductivité électrique. Le Leica TCS SP8 peut exploiter trois à cinq de ses longueurs d'onde, selon le diviseur de faisceau utilisé.

Un autre type de laser à gaz important utilisé avec le Leica TCS SP8 est l'hélium-néon (HeNe). Dans ce type de laser, l'hélium sert de support de la pompe, tandis que le néon est le matériau à effet laser. L'hélium est électriquement excité et transfère l'énergie de pompage aux atomes de néon par collision. Les lasers HeNe sont principalement utilisés dans les gammes orange et rouge ; les lasers HeNe verts ont quant à eux été remplacés par des lasers à l'état solide plus puissants. Pour poursuivre votre lecture, consultez l'article sur les lasers hélium-néon sur Wikipedia.

Lasers à fibre

 

Le terme « laser à fibre » fait référence à la construction du milieu amplifiant ou à une fibre permettant la modification de la lumière du laser. Pour les microscopes Leica TCS SP8 X et Leica TCS SP8 STED avec STED limité, des lasers dits « de supercontinuum » (lasers à lumière blanche) sont utilisés. Le terme « supercontinuum » fait référence à la présence d'effets non linéaires dans la fibre photonique, qui convertissent la longueur d'onde unique d'une source de pompage en un spectre large. Le laser de supercontinuum mis en œuvre produit un spectre blanc librement ajustable de 470 à 670 nm.

Les sources de laser traditionnelles ne procurent qu'une, ou un petit nombre de lignes de longueur d'onde individuelle. Par conséquent, de grands fossés dans le spectre d'excitation limitent les possibilités d'excitation de colorants non standards et de nouvelles protéines fluorescentes. Les sources lumineuses telles que les lampes halogènes ou aux halogénures, quant à elles, produisent un spectre large, mais ne conviennent pas à la microscopie confocale en raison de certaines contraintes au niveau de la luminosité et d'un manque de cohérence.

Le laser à lumière blanche offre la flexibilité et les caractéristiques à large bande d'une lampe, associées à luminosité et la cohérence d'un laser. Le modèle de Leica combine cette source ajustable au diviseur de faisceau AOBS lui-même ajustable et à la détection multispectrale. Ainsi, chaque élément du processus de fluorescence, à savoir la longueur d'onde d'excitation, la sélection de ligne, la combinaison de couleurs et la bande de détection, reste sous le contrôle total de l'utilisateur. L'ajustement en temps réel de huit lignes maximum en simultané offre des milliards de combinaisons possibles pour le réglage de l'excitation laser. Le laser à lumière blanche étant une source à impulsion, il peut également être utilisé comme source flexible pour l'imagerie de fluorescence résolue en temps, en particulier pour couvrir les parties les plus délicates du spectre, à savoir le vert, jaune et orange.

Leica voit au-delà de ces applications les plus évidentes, et utilise les propriétés du WLL pour de nombreuses nouvelles applications. Capable d'un ajustement µs, le système peut enregistrer des spectres d'excitation-émission bidimensionnels, ce qui demande une dimension supplémentaire pour la séparation des fluorophores et la caractérisation des composants fluorescents d'un échantillon. De plus, en combinaison avec les HyD utilisés comme détecteurs compteurs de photons, la lumière fluorescente peut être séparée en plusieurs composants à l'aide d'un mécanisme à émission et réception alternées (LightGate). Ainsi, chaque canal est en mesure d'offrir plus d'informations sur les composants dérivés de la réflexion, des colorants fluorescents et de l'autofluorescence, en fonction de la durée de vie de fluorescence respective. La suppression sans filtre de la réflexion, et le démêlage de mélanges complexes d'espèces à fluorescence sont possibles. Alliée aux systèmes STED, cette technologie augmente la super-résolution à moins de 50 nm. Poursuivre votre lecture sur le WLL :

  • Pour plus d'informations sur la génération de supercontinuum, l'ajustement de longueur d'onde, les balayages excitation-émission et LightGate, veuillez consulter l'article sur le Leica Science Lab par Rolf Borlinghaus et Lioba Kuschel.
  • Une analyse des états métaboliques des biofilms est présentée dans un article de Roldán et Hernández-Mariné.
  • Un article sur la TCSPC FLIM utilisant le WLL par Corentin Spriet et al. est également disponible.