Lentilles d'objectif pour l'imagerie confocale

L'imagerie confocale est extrêmement exigeante sur les lentilles d'objectifs. Pour bénéficier pleinement de la résolution de l'imagerie confocale, le point focal créé par l'objectif doit offrir une diffraction limitée pour la totalité de la plage de longueur d'onde de l'application et son champ de vision. En imagerie confocale, les réglages d'objectif les plus importants sont l'ouverture numérique (NA), la correction chromatique et la rectitude de champ.


Ouverture numérique

L'ouverture numérique (NA) détermine le pouvoir de résolution et la luminosité d'une image. C'est une mesure de la largeur et la profondeur du point focal produit par un objectif. Elle est définie par le sinus du demi-angle d'ouverture a de la lentille et l'indice de réfraction n du milieu d'immersion (Figure 1). Selon cette définition, plus l'ouverture numérique est grande, plus le point focal est étroit et par conséquent, plus le pouvoir de résolution est élevé.

La NA suivant une échelle linéaire identique à l'indice de réfraction n, il est nécessaire d'avoir un milieu d'immersion avec un indice de réfraction supérieur à 1 (donc autre que l'air) si la NA est supérieure à 1. Une NA plus élevée exige typiquement une conception plus complexe avec de nombreux éléments optiques et de plus hautes tolérances. La Figure 2 représente une comparaison du foci produit par des objectifs 40x à différentes NA, obtenue au moyen de leur fonction de dispersion du point (PSF).

Figure 1 Définition de l'ouverture numérique (NA) La NA est une mesure de la largeur du point focal. Elle dépend du sinus du demi-angle d'ouverture alpha et de l'indice de réfraction n du milieu d'immersion. NA = n • sin alpha (où n=1 pour l'air).

Figure 2 Comparaison des tailles de point focal comme fonction de l'ouverture numérique. Les PSF calculés représentent les intensités normalisées sur deux coordonnées spatiales. Une NA élevée engendre un plus grand pouvoir de résolution, indiqué par un point de petite taille.

Correction chromatique

Une lentille idéale effectuerait la mise au point d'une source lumineuse ponctuelle dans un PSF idéal dont les dimensions seraient déterminées par la NA de l'objectif et la longueur d'onde de la lumière. Cependant, la forme et la position d'un PSF réel dévient de celles d'un PSF idéal en raison des imperfections inhérentes aux lentilles réelles. Ces imperfections causent ce que l'on appelle des aberrations. Les aberrations provoquant une forme non idéale du PSF ont un effet négatif sur la résolution et le contraste (aberration sphérique, coma, astigmatisme). Un positionnement décalé du PSF conduit à une géométrie d'image (courbure, distorsion) ou des transparences chromatiques et luminosités d'image suboptimales.

En imagerie confocale, la coupe en z et l'imagerie multispectrale sont en forte demande, et c'est la raison pour laquelle les aberrations chromatiques et la courbure demandent une attention particulière. Les aberrations chromatiques peuvent être réduites par certaines lentilles spécialement conçues pour veiller à ce que différentes longueurs d'onde soient focalisées en un même point sur les dimensions xy et z. Toute déviance par rapport à l'idéal entraîne une réduction de la qualité des expériences de colocalisation en caractérisation fonctionnelle, car une personne pourrait alors tirer de fausses conclusions à partir du coefficient de corrélation correspondant. De plus, une meilleure correction chromatique permet un recueil de lumière plus efficace en raison d'une superposition plus large des PSF d'excitation et d'émission (voir Figure 3).

Figure 3 Illustration de la dépendance du signal confocal aux aberrations chromatiques (informatisée) Basée sur une lentille idéale 63x/1.40 NA avec un radius Airy ~ 190 nm, trou carré infiniment petit et excitation à 405 nm

Une classe d'objectifs pour le balayage confocal : HC PL APO CS2*

L'introduction d'éléments optiques complémentaires permet une meilleure correction des aberrations chromatiques, sphériques ou autres. Ces éléments exigent un procédé de fabrication haute précision. Ainsi, leur conception est plus complexe et leur coût de production augmente.

Les objectifs sont catégorisés selon trois classes, par ordre de qualité croissant : achromates, semi-apochromates et apochromates. Les apochromates offrent une correction pour la plus grande plage spectrale. Dans sa classe d'apochromates, Leica offre des optiques spécialement conçues pour répondre aux plus hautes spécifications de balayage confocal (CS). La plus récente série CS2 est une amélioration de la précédente série CS, et la nouvelle correction de couleur latérale s'accompagne d'une nouvelle optique UV pour le Leica TCS SP8. L'excellente correction de couleur des objectifs CS2 procure une superposition des couleurs améliorée, particulièrement sur la périphérie de l'image.

*Abréviations :

PL plan, correction de rectitude de champ

APO apochromatique, corrigé pour les plages de longueurs d'onde rouges, bleues et vertes.

Un aperçu plus général des différentes classes d'objectifs proposées par Leica Microsystems est consultable ici.

Dédié à l'excitation avec 355 nm : HC PL APO UVIS CS2

Avec le HC PL APO 63x/1.20 W CORR UVIS CS2, nous proposons un objectif à bande ultra large dédié à l'excitation avec 355 nm. Il procure une excellente correction de couleur de 345 à 730 nm. Il est donc idéal pour les expériences de photoactivation, de libération et de physiologie à l'aide d'une imagerie de ratio et de ligne individuelle Ca2+, pour la surveillance de l'expression génétique ou encore l'autofluorescence.

Objectifs pour l'imagerie multiphotons et CARS : HC PL IRAPO

Figure 4 Sélection d'objectifs IRAPO Les infrarouges-apochromates sont corrigés pour la plage proche infrarouge du spectre de longueur d'onde. Ceci les rend idéaux pour l'imagerie MP, y compris l'excitation avec OPO ou CARS.

À l'autre extrême du spectre de couleurs, un nouvel ensemble d'objectifs spécialisés est désormais disponible pour une imagerie multiphotons (MP) améliorée. Les nouveaux apochromates IR (Figure 4) ont subi une correction de couleur jusqu'à 1 300 nm et offrent une excellente transmissivité dans les plages de longueurs d'onde visibles et infrarouges avec > 85 % de transmission de 470 à 1200 nm, ce qui les rend idéaux pour l'imagerie non linéaire telle que l'imagerie multiphotons multicolore, y compris l'excitation avec OPO (oscillateur paramétrique optique) et CARS (Diffusion Raman anti-Stokes cohérente). Voir également la Figure 5.

Figure 5 Présentation des différentes corrections de couleur offertes en microscopie confocale par différents types d'objectifs, à savoir respectivement CS2, UVIS CS2 et IR APO Les corrections de couleur respectives IRAPO, PL APO CS2 et PL APO UVIS CS2 ont été conçues pour prendre en charge des applications spécifiques de façon optimale, veillant à ce que la colocalisation et l'efficacité de détection restent élevées sur tout le champ de balayage. Le graphique représente la superposition des plages optimales (zone à contour solide) et plages exploitables (zones à contour discontinu) dans l'optique d'obtenir une couverture totale de la plage de longueur d'onde, de 355 à 1 300 nm. Pour ce qui est de la zone verte pointillée entre 405 et 450 nm, la correction de couleur est possible avec certains objectifs CS2. En associant ces objectifs à une optique de balayage optimale, il est possible de bénéficier d'une excellente flexibilité d'application, tant que l'objectif adéquat est utilisé pour chaque expérience.