Scanner FOV (Field of View)

Capturez tout en une seule prise.

 

Les microscopes ont certes été inventés pour examiner les détails les plus infimes, mais toute observation a souvent besoin d'être remise en contexte. Pour cela, l'échantillon doit être observé dans son environnement. La taille de la zone visible d'une image microscopique est déterminée par le champ de vision (Field of View, FOV) du microscope. Le champ de vision d'un instrument confocal est influencé par l'agencement optique créé par les lentilles d'objectif, l'optique de balayage et le scanner. Pour obtenir un grand champ de vision, le défi technique consiste à éclairer de façon homogène la zone d'observation sans perdre de résolution entre son centre et ses extrémités.

Éclairage homogène sur un microscope à balayage laser confocal

 

Les microscopes à balayage scanner les plus simples sont dotés d'une lentille d'objectif OL et d'un miroir de balayage MSc (Figure 1). Selon cette conception, le fait de basculer légèrement le miroir de balayage (ce qui est nécessaire pour le processus de balayage) empêchera la pupille de la lentille d'objectif (illustrée en ouverture orange) de se remplir complètement. Par conséquent, les bordures de l'image ne sont pas correctement illuminées. Cela provoque une perte d'intensité et de résolution.


Figure 1 En plus de l'objectif, les systèmes confocaux utilisent généralement une lentille de tube TL positionnée à une distance fTL du plan de tirage de l'objectif, et une lentille de balayage ScL positionnée à une distance fScL du plan de tirage de la lentille de tube afin de parvenir à un éclairage à diffraction limitée (Figure 2). Si le miroir de balayage est ensuite positionné à une distancefScL de la lentille de balayage, il s'agit d'un « concept 4 f », puisque les quatre longueurs focales f entre l'objectif et le miroir de balayage sont couvertes. La pupille est aussi toujours complètement pleine, quelle que soit la position du miroir de balayage, procurant un éclairage homogène de la totalité du champ.

Figure 2 : Éviter le vignettage et la perte de résolution périphérique grâce à une conception de scanner 4f La lentille de balayage (ScL) et la lentille de tube (TL) sont positionnées de manière à conjuguer le miroir de balayage (MSc) à la pupille arrière de la lentille d'objectif (OL).

Dans un système confocal à deux miroirs de balayage (un pour la dimension x, un pour la dimension y), un compromis est nécessaire lors du positionnement des miroirs de balayage. L'un des miroirs, ou les deux, sont déplacés en dehors du plan conjugué. Cela limite le champ exploitable, car une perte d'intensité et de résolution est observée aux extrémités du champ.

Contrairement à tous les autres scanners confocaux, le scanner Leica X2Y intégré au Leica TCS SP8 utilise trois miroirs de balayage, un pour la dimension x et deux pour la dimension y. Le deuxième miroir Y du scanner X2Y garantit que l'axe de rotation du rayon lumineux dans la pupille arrière de l'OL soit toujours centré. Ainsi, le design optimal 4f peut être maintenu afin d'éviter le vignettage et la perte de résolution (Figure 3).

Figure 3 X2Y scanner design to maximize field of view by introducing a second Y-galvanometer mirror. The X2Y-system ensures the pivot-plane of the scanning beam is not moving laterally. This avoids image degradation off-center that occurs, when the mirror is not placed in a plane conjugated to the back focal plane.

Les scanners XY ont un champ limité, mais lorsqu'ils sont associés au système de balayage X2Y, l'indice de champ augmente jusqu'à 22. À un grossissement 10x, cela équivaut à un carré de 1,5 x 1,5 mm2. Un champ de vision élargi permet d'insérer un plus grand spécimen dans une seule et même image, ou simplement d'ajouter du contexte à une topologie complexe telle qu'un échantillon de tissu (Figure 4).

Figure 4 : Platynereis dumerilii, 2 mois. Bleu : noyau atomique, DAPI. Vert : tubuline, FITC. Gris : phalloïdine, rhodamine. Rouge : sérotonine, Cy5. L'organisme entier tient dans une seule et même image (FOV). Projection 3D maximale d'une image prise avec un objectif 10x complètement dézoomé au format de balayage 5000 x 5000. Échantillon : avec l'aimable autorisation du Dr Antje Fischer et du Dr Detlef Arendt, Heidelberg (Allemagne)