Trou carré

La microcopie confocale permet l'enregistrement de sections optiques. Cela est rendu possible grâce à une ouverture variable située sur le plan focal conjugué (plan confocal) de l'axe optique : le trou de détection confocale. Il empêche la lumière hors du plan focal d'atteindre le détecteur, ce qui entraîne une amélioration de la résolution le long de l'axe optique (orienté Z) d'un facteur d'environ 1,4 en comparaison avec le microscope de grand champ (pour plus d'informations sur le trajet optique d'un microscope confocal, veuillez vous rendre sur le Leica Science Lab. Sur le plan confocal, chaque point de l'échantillon apparaît comme une figure de diffraction type, également connue sous le nom de figure Airy (Figure 1) et dont le maximum de diffraction central est appelé le disque Airy. La lumière hors du plan focal est représentée comme le maximum d'ordre supérieur de la figure. Le trou est typiquement ajusté de façon à laisser passer le maximum principal (la lumière du plan focal) vers le détecteur pour être enregistré. Ce réglage est connu sous le nom d'1 unité Airy.


Puisque par ailleurs, l'addition d'un trou carré entraîne une perte de lumière, il est conseillé d'avoir recours à un trou carré de taille ajustable afin de pouvoir équilibrer le gain et la perte de lumière (pour plus de détails sur la résolution et les unités Airy, veuillez vous rendre sur le Leica Science Lab. Il est techniquement difficile d'obtenir un diamètre de trou carré ajustable et donc d'obtenir une géométrie circulaire parfaite. C'est pourquoi l'on préfère avoir recours à d'autres géométries. La forme la plus courante est la géométrie de trou hexagonale, semblable aux ouvertures d'objectifs utilisées en photographie. La lumière n'a pas encore été détectée lorsqu'elle atteint le plan confocal, mais elle doit traverser le système de détection où elle sera divisée selon les dimensions spectrales utilisées en imagerie multispectrale. Après que la lumière a été dispersée par un prisme situé dans le microscope confocal Leica, chaque couleur provoque l'apparition d'une figure de diffraction unique (Figure 2). Mieux leurs maximums principaux seront séparés, plus le pouvoir de résolution spectrale du microscope confocal sera élevé. La géométrie de trou a un impact majeur sur la figure de diffraction (Figure 3, ligne supérieure). Il s'avère qu'un arrangement de trou carré est le plus bénéfique dans l'annulation des maximums secondaires problématiques, et améliore donc la résolution spectrale (Figure 3, ligne inférieure). En microscopie de fluorescence, chaque structure (biologique) d'intérêt est spécifiquement étiquetée d'une couleur unique, et la colocalisation de ces structures transmet des informations importantes sur leur fonction biologique. La particularité spectrale obtenue par un trou carré permet d'obtenir une meilleure caractérisation fonctionnelle de l'échantillon multicolore.

Figure 1 : Le trou confocal provoque l'apparition d'une figure de diffraction dans le plan confocal. Son maximum principal (ordre zéro) est considéré comme étant égal à une unité Airy, et constitue l'équivalent physique de la lumière présente sur ce plan. Changer la taille du trou permet d'équilibrer la résolution optique et l'intensité lumineuse. La taille physique du trou dépend de la géométrie exacte du trajet optique et du grossissement de l'optique. Les unités Airy sont donc plus utiles pour comparer la taille des trous plutôt que leur diamètre physique.


Figure 2 : Figures de diffraction pour deux couleurs, après avoir traversé un prisme. En imagerie multispectrale, la spécificité spectrale est influencée par la capacité à dissoudre deux figures de diffraction adjacentes.

Figure 3 : Figures de diffraction causées par différentes géométries de trou (illustration schématique basée sur des figures de diffraction informatisées). Ligne supérieure : Trou circulaire (A), hexagonal (B) et carré (C). Ligne inférieure : Séparation de deux figures adjacentes, causée par différentes couleurs pour des géométries circulaires (D), hexagonales (E) et carrées (F). La séparation des couleurs est importante en imagerie multispectrale. Grâce à son manque d'intensité entre les deux maximums de diffraction de premier ordre, la géométrie de trou carré permet une suppression aisée des ordres supérieurs. Le gain en séparation spectrale est d'environ 1,5 (brevet américain 6,801,359 B1).