Milieux d'immersion pour objectifs

Pour une haute puissance de résolution, l'ouverture numérique (NA) d'un objectif doit être supérieure à 1. Il faut également un milieu d'immersion dont l'indice de réfraction est supérieur à 1, autre que l'air. Les milieux d'immersion les plus courants sont l'huile, l'eau et le glycérol. Le milieu d'immersion qui devrait être utilisé est indiqué sur l'objectif.

HUILE

Huile d'immersion standard DIN/ISO

W

Eau

GLYC

Glycérol

IMM

Autre milieu d'immersion, ou plus d'un seul milieu

 

 

Tous les éléments d'optique (milieu d'immersion, couvre-objet, échantillon) devant la lentille frontale de l'objectif ont une influence majeure sur la qualité de l'image. Idéalement, l'indice de réfraction sur toutes ces couches optiques doit correspondre aux indices de réfraction pour lesquels a été conçu l'objectif. Mais en réalité, ceci est difficile, car les échantillons sont souvent inhomogènes, l'épaisseur du couvre-objet n'est pas très précise et la température varie durant le processus d'acquisition d'image. Ces facteurs doivent être gardés en mémoire lors de la sélection de l'objectif et du milieu d'immersion dans le cadre d'une certaine application.

Indices de réfraction de certains milieux d'immersion les plus importants

Cellules de culture

1,33 - 1,38

Huile de type F

1,52

Glycérol

1,45 (21 °C) - 1,46 (37 °C) pour un liquide d'immersion Leica de type G

Huile silicone

1,41

Eau

1,33

100 % PBS pH 8,9

1,34

Mowiol

1,46

Baume du Canada

1,52

Couvre-objet

1,52

 

Plus l'ouverture numérique de l'objectif est grande et plus les structures d'intérêt de l'échantillon sont profondes, plus il est important de faire correspondre les indices de réfraction de l'échantillon et du milieu d'immersion. Des indices de réfraction différents entraînent des aberrations sphériques et des distorsions géométriques des structures. Cela entraîne ensuite une perte de contraste et de définition ainsi que des structures apparaissant comprimées ou étirées.

Huile

 

 

L'indice de réfraction de l'huile d'immersion Leica de type N et F est de 1,518 (à 23 °C et 546 nm), c'est-à-dire le même que celui du crown-glass standard (n=1,518). Pour l'imagerie multicolore, la dispersion de l'huile d'immersion est elle aussi importante. On l'appelle souvent le nombre d'Abbe, et il doit correspondre au nombre d'Abbe pour lequel l'objectif a été conçu, car des aberrations chromatiques pourraient autrement survenir. Par exemple, l'huile d'immersion Leica de type N a pour nombre d'Abbe 42,1 tandis que l'huile d'immersion de type F a un nombre d'Abbe de 46, optimal pour l'imagerie de fluorescence. Le type N n'est pas adapté à l'imagerie de fluorescence.

Les objectifs à immersion dans l'huile sont idéaux pour les échantillons immergés dans un milieu ayant le même indice de réfraction que l'huile, c'est-à-dire, de manière générale, les spécimens fixes figés dans de la résine, du baume du Canada ou du glycérol-gélatine, ou qui sont observés très proche du couvre-objet (à moins de quelques µm). Plus on s'éloigne du couvre-objet, plus la clarté et la résolution de l'image se détériorent si les indices de réfraction sont dépareillés.

Pour l'imagerie de cellules vivantes, autrement dit l'imagerie d'échantillons aqueux, nous recommandons fortement l'utilisation de l'immersion dans l'eau ou le glycérol.

Les objectifs à immersion dans l'huile avec des ouvertures très grandes procurent uniquement leurs performances optiques optimales dans un intervalle de température relativement restreint puisque l'indice de réfraction de l'huile d'immersion dépend essentiellement de la température : Plus la distance de travail est élevée, plus la couche d'huile sera épaisse et donc plus les aberrations liées à la température auront d'impact sur la qualité d'image. Cet effet de température change de façon linéaire avec la distance de travail, mais dépend de l'ouverture numérique.

Pour les expériences réalisées à des températures non ambiantes, l'immersion dans l'eau est recommandée, car l'indice de réfraction de l'eau dépend beaucoup moins de la température et peut être compensé, notamment parce que de nombreux objectifs à immersion dans l'eau sont dotés de bagues de correction.

Eau

 

 

Les objectifs à immersion d'eau sont optimaux pour l'observation de cellules vivantes dans des milieux aqueux, car les indices de réfraction du milieu d'immersion et de l'échantillon se correspondent mieux que dans le cas de l'huile d'immersion, par exemple. L'eau, en revanche, s'évapore rapidement à 37 °C. Le micro distributeur d'immersion aquatique Leica ajoute automatiquement de l'eau pendant le déroulement de l'expérience afin de garantir une immersion stable.

Glycérol

 

 

Aujourd'hui, la majorité des échantillons fixes tels que les cellules de culture, les coupes de tissu de spécimens épais et les embryons in toto sont placés dans des mélanges de Mowiol, Vectashield ou semblable contenant de l'eau, du glycérol et divers produits chimiques, par ex. des substances anti-décoloration ou de conservation. Ces milieux d'immersion ont des indices de réfraction proches du mélange glycérol/eau 80 %/20 % (n = 1,45). Les objectifs à immersion dans le glycérol sont excellents pour les échantillons placés dans un milieu ayant un indice de réfraction proche des 1,45 – 1,46.

Les objectifs Leica à immersion dans le glycérol sont dotés d'une bague de correction permettant d'ajuster l'optique à divers indices de réfraction résultant notamment de différentes compositions des milieux de placement, ou de variations dans l'épaisseur du couvre-objet ou de la température. La Lettre d'application N° 17 (avril 2004) offre une description très détaillée des objectifs à immersion dans le glycérol, et des effets d'une mauvaise correspondance entre les indices de réfraction.

Objectif à utiliser lors d'une immersion dans le glycérol :

HC PL APO 63x/1,30 GLYC CORR CS2


La plupart des objectifs multi-immersion (IMM) peuvent être utilisés dans le glycérol, comme dans l'eau ou l'huile (voir ci-dessous).

Multi-immersion

 

 

Les objectifs adaptés à plusieurs liquides d'immersion (par ex. l'huile, l'eau et le glycérol) peuvent être utilisés avec le milieu d'immersion optimal de nombreux échantillons.

Objectifs multi-immersion :

HC PL APO 10x/0,40 IMM CS
HC PL APO 20x/0,75 IMM CS2