Il metodo della spettroscopia a correlazione di fluorescenza (FCS)

La FCS è un metodo di misurazione basato sulla fluorescenza. Le molecole fluorescenti, passando attraverso un raggio laser fisso altamente concentrato, vengono eccitate ed emettono fluorescenza. Una volta passati attraverso un foro stenopeico confocale, i fotoni emessi vengono registrati da rilevatori altamente sensibili.

Le misurazioni FCS vengono eseguite con il sistema Leica TCS SP8 SMD.


Parametri quantitativi derivati da una curva di autocorrelazione

Le particelle in movimento danno origine a fluttuazioni d'intensità. Un'autocorrelazione di ciò rivela informazioni sulla scala molecolare: l'ampiezza della curva di correlazione mostra il numero della particella. Il tempo al punto di flesso contiene informazioni sulla mobilità della particella. Infine, inclinazione e forma della curva riflettono il tipo di diffusione. Concentrazione e massa della particella, viscosità e frazione legata possono essere ottenuti da questi parametri.

Principio di acquisizione e analisi dati FCS

 

  1. L'illuminazione laser ad un punto di interesse fisso (posizionamento del raggio) eccita le particelle fluorescenti nel volume di eccitazione. Il movimento delle particelle in entrata e in uscita dal volume confocale causa fluttuazioni di intensità.
  2. Registrazione delle fluttuazioni di intensità utilizzando rilevatori in modalità di conteggio a fotone singolo.
  3. Calcolo della funzione di correlazione.
  4. Adeguamento del modello biofisico corrispondente alla curva di correlazione. Ottenimento di parametri di interesse:

    • concentrazione delle particelle
    • coefficiente di diffusione
    • viscosità
    • massa molecolare
    • costante di legame
    • proprietà foto-fisiche

1. Laser illumination at a fixed point of interest (beam parking) excites fluorescent particles in the excitation volume. The particle movement in and out of the confocal volume causes intensity fluctuations.
3. Calculation of the correlation function<br>4. Fitting of the corresponding biophysical model