FLIM FRET: il metodo

FLIM-FRET: Il righello molecolare

 

Un'applicazione tipica di FLIM è FLIM-FRET. La FRET è una tecnica ben consolidata per lo studio delle interazioni molecolari. Inoltre, permette di analizzare legami tra proteine e fornisce una stima delle distanze intermolecolari in Angström. Il sistema Leica TCS SP8 SMD, insieme allo strumento di analisi avanzata FRET, di cui è dotato il software SymPhoTime di PicoQuant, offre una solida base per questo genere di studi e risultati di alta qualità.


L'effetto FRET

In un esperimento FRET, i potenziali partner di legame vengono marcati con fluorofori spettralmente distinti in modo che lo spettro d'emissione della molecola donatrice si sovrapponga a quello d'eccitamento della molecola accettatrice.

Se entrambi i partner coinvolti nell'interazione sono a stretto contatto, separati soltanto da una distanza di pochi nanometri, il donatore eccitato può trasferire la propria energia all'accettore. A sua volta, l'accettore emetterà un fotone di fluorescenza e il tempo di vita della fluorescenza della molecola donatrice diminuirà.

Perché FLIM-FRET 

 

I metodi FRET, basati sull'intensità, sono piuttosto suscettibili di variazioni del livello d'espressione o di diffusione molecolare insiti nel campione. Questo riguarda anche influenze esterne, come le interferenze dovute ai movimenti del campione e alla fluttuazione dell'eccitazione.

A questo proposito, FLIM-FRET è di grande vantaggio poiché è dotato di calibrazione interna. Consente misurazioni FRET indipendentemente dalle interferenze. In FRET si osserva un accorciamento del tempo di vita del donatore. Questo valore è una misura dell'efficienza FRET.

La combinazione di FLIM-FRET e SP FLIM può servire sia a migliorare la qualità dei dati sia ad aumentare la precisione delle misurazioni quantitative.

Donatore e accettore sono separati da una distanza r >>R<sub>0</sub>
A distanza più ravvicinata, r~R<sub>0</sub> FRET induce l'emissione di fluorescenza nell'accettore.