Le misurazioni FLIM vengono condotte con Leica TCS SP8 SMD in configurazione FLIM.

Definizione del tempo di vita della fluorescenza

 

Il tempo di vita della fluorescenza è una misura del tempo medio di permanenza allo stato eccitato del fluoroforo, prima che ritorni allo stato fondamentale emettendo un fotone di fluorescenza. L'emissione di un fotone di fluorescenza da un fluoroforo non si verifica ad un tempo fisso. Al contrario, si osserva una distribuzione temporale descrivibile con una funzione di decadimento esponenziale. La costante di tempo caratteristica di questo decadimento, il  tempo di vita della fluorescenza, ricade in un intervallo che va da pochi picosecondi (10-12 s) a diverse decine di nanosecondi (10-9 s).

Tempo di vita della fluorescenza come sonda del nanoambiente.

 

Il tempo di vita è un parametro caratteristico di ciascun colorante fluorescente e può cambiare in funzione del microambiente o dello stato conformazionale. L'informazione del tempo di vita sonda la composizione dell'ambiente molecolare in riferimento a concentrazione ionica, pH, grado di lipofilia o legame con altre molecole.

Combinazione di misura del tempo di vita e Imaging 

 

La tecnica FLIM combina misura del tempo di vita e Imaging: i tempi di vita ottenuti sono codificati con colori a livello pixel per produrre immagini. Di conseguenza, FLIM consente di ottenere informazioni sulla distribuzione spaziale di una molecola fluorescente, insieme alle informazioni sul suo nano-ambiente. In questo modo si ottiene una dimensione aggiuntiva delle informazioni.

Principio di acquisizione e analisi dati FLIM

 

  1. Ripetute misurazioni del tempo intercorso fra impulso laser ed emissione del fotone di fluorescenza per ogni pixel.
  2. Elaborazione di un istogramma di conteggio dei fotoni pervenuti dopo l'impulso laser.
  3. Adeguamento del decadimento esponenziale per ciascun  istogramma. L'ampiezza riflette il numero totale di fotoni, la costante di tempo τ viene chiamata tempo di vita della fluorescenza.
  4. Visualizzazione dell'immagine del tempo di vita utilizzando una tabella di associazione a colori falsi.
Acquisizione e analisi dei dati FLIM, Fase 1
Fase 4