Foro stenopeico quadrato

La microscopia confocale permette la registrazione di sezioni ottiche. Ciò è reso possibile da un'apertura variabile situata nel piano focale coniugato (piano confocale) sull'asse ottico, il foro stenopeico di rilevazione confocale. Tale foro impedisce alla luce fuori fuoco di raggiungere il rilevatore, portando ad un miglioramento della risoluzione lungo l'asse ottico (direzione Z) di un fattore di circa 1.4 rispetto alla microscopia a campo largo (per maggiori informazioni sul percorso ottico di un microscopio confocale si prega di fare riferimento a Leica Science Lab). Nel piano confocale ogni punto nel campione appare come un tipico schema di diffrazione noto anche come modello di Airy (Figura 1), con il massimo centrale di diffrazione indicato come disco di Airy. La luce fuori fuoco è rappresentata come i massimi di ordine superiore del modello. Normalmente il foro stenopeico è regolato in modo da permettere al massimo principale, la luce a fuoco, di essere registrata dal rilevatore. Questa configurazione è indicata come 1 unità di Airy.


Poiché, d'altra parte, l'aggiunta del foro stenopeico causa una perdita di luce, è preferibile avere un foro stenopeico di dimensione regolabile per bilanciare il guadagno di risoluzione e la perdita di luce (per maggiori dettagli su risoluzione ed unità di Airy si prega di fare riferimento a Leica Science Lab). Realizzare un diametro regolabile di un foro stenopeico dalla geometria perfettamente circolare è tecnicamente difficile, per questo motivo si preferiscono altre geometrie. La forma più comune è la geometria esagonale del foro stenopeico, simile alle aperture negli obiettivi utilizzati in fotografia. A livello del piano confocale, la luce non è stata ancora rilevata, ma deve arrivare al sistema di rilevazione, dove è poi ripartita lungo la dimensione dello spettro per l'Imaging multispettro. Dopo la dispersione della luce, che nei confocali Leica avviene per mezzo di un prisma, ogni colore dà origine ad un unico schema di diffrazione (Figura 2). Più sono separati i massimi principali, maggiore sarà il potere di risoluzione dello spettro del microscopio confocale. La geometria del foro stenopeico ha un forte impatto sullo schema di diffrazione (Figura 3, riga superiore). Ne risulta che un foro stenopeico quadrato è più efficace per eliminare i problematici massimi secondari determinando perciò una migliore risoluzione dello spettro (Figura 3, riga inferiore). Nella microscopia a fluorescenza tutte le strutture (biologica) di interesse vengono specificamente marcate con un unico colore e la loro colocalizzazione fornisce importanti informazioni sulla funzione biologica. La specificità dello spettro ottenuta attraverso un foro stenopeico quadrato può quindi risultare in un miglioramento della caratterizzazione funzionale del campione multicolore.

Figura 1: Il foro stenopeico confocale determina uno schema di diffrazione nel piano confocale. Una unità di Airy è definita come il suo massimo principale (ordine zero) ed è l'equivalente fisico della luce a fuoco. Modificando la dimensione del foro stenopeico si possono bilanciare la risoluzione ottica e l'intensità della luce. La dimensione fisica del foro stenopeico dipende dall'esatta geometria del percorso del fascio e dall'ingrandimento dell'ottica. Perciò le unità di Airy sono più utili per confrontare le dimensioni del foro stenopeico piuttosto che il suo diametro fisico.


Figura 2: Modelli di diffrazione per due colori dopo il passaggio attraverso un prisma. Nell'Imaging multispettro la specificità dello spettro è influenzata dalla capacità di risolvere due schemi di diffrazione adiacenti.

Figura 3: Gli schemi di diffrazione dovuti a geometrie diverse del foro stenopeico (illustrazione schematica basata su schemi di diffrazione computerizzati.). Riga superiore: Foro stenopeico circolare (A), esagonale (B) e quadrato (C). Riga inferiore: Separazione di due schemi adiacenti dovuti a colori differenti per una geometria circolare (D), esagonale (E) e quadrata (F). La separazione dei colori è importante per l'Imaging multispettro. Grazie alla sua mancanza di intensità tra i due massimi di diffrazione di primo ordine, la geometria quadrata del foro stenopeico permette di sopprimere gli ordini superiori nel modo più semplice. Il guadagno nella separazione degli spettri è approssimativamente di 1.5 (Brevetto US 6,801,359 B1).