Leica HyDTM

 

La rilevazione ibrida combina il meglio di PMT e APD

 

Lo scopo del fotorilevatore è di convertire la luce in segnali elettrici. Per questo motivo è un componente critico del processo di registrazione. Non solo deve captare la fluorescenza nel modo più efficiente possibile, ma deve anche essere caratterizzato da intervallo dinamico ampio, risposta rapida e basso rumore di fondo per produrre immagini nitide e quantificabili. Per molto tempo, i tubi fotomoltiplicatori (photomultiplier tubes, PMT) e i loro derivati, come le matrici multianodo, hanno costituito lo standard nei fotorilevatori confocali. Il loro intervallo dinamico ampio e il ragionevole livello di rumore di fondo contribuiscono a questo successo.


Tuttavia, i PMT presentano limiti per la quantificazione e l'Imaging con bassa luminosità a causa di una sensibilità limitata e una lenta risposta all'impulso. A questo scopo, per l'Imaging a bassa luminosità sono stati impiegati i fotodiodi a valanga (Avalanche photo-diodes, APD). Tuttavia, a causa del loro intervallo dinamico ristretto e dei loro stati oscuri prolungati, gli APD restano rilevatori utilizzati per scopi speciali.

Attualmente, in alternativa, i fotorilevatori ibridi così come applicati in Leica HyDTM combinano elementi presi da entrambi, PMT e APD. Invece di una lunga cascata di dinodi come nei PMT (Figura 1 A), che possono causare perdita di fotoni e propagazione del rumore di fondo, i fotorilevatori ibridi utilizzano una geometria semplice con una fase di bombardamento con elettroni che produce un guadagno elevato (10³) in un unico passaggio.

Figura 1: Principio di funzionamento di fotorilevatori diversi: fotomoltiplicatori (A) e fotorilevatori ibridi (B). Entrambi i rilevatori utilizzano l'effetto fotoelettrico al fotocatodo per convertire la luce in elettricità. Tuttavia, l'amplificazione a valle differisce notevolmente. I PMT utilizzano una cascata di dinodi per creare guadagno, mentre gli HyD impiegano una procedura a due passaggi che consiste in una fase di bombardamento con elettroni e nel guadagno a valanga. Gli HyD producono quindi immagini con un buon contrasto e un buon rapporto segnale/rumore; inoltre possiedono eccellenti proprietà per il conteggio dei fotoni per la quantificazione

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Figura 2: Leica HyDTM sono disponibili come HyD SP multispettro (A) o HyD-RLD nella posizione non descansionata (B)

Il secondo passaggio somiglia ad un APD per quanto riguarda gli elettroni secondari che sono ulteriormente amplificati in un semiconduttore tramite un effetto a valanga (Figura 1B, vedere anche il tutorial degli HyD su Leica Science Lab). Questa disposizione rende gli HyD molto sensibili, producendo al contempo un basso rumore termico e impulsi in ritardo quasi nulli. Tali proprietà li rendono adatti ad un'ampia gamma di campioni. Per un confronto approfondito tra i tre tipi di rilevatori, si prega di consultare il relativo articolo di Rolf Borlinghaus su Leica Science Lab. Dal momento che gli HyD hanno un tempo morto molto breve e impulsi di risposta brevi dell'ordine di circa 100 ps, essi possono applicare il conteggio dei fotoni a campioni più luminosi rispetto ad altri rilevatori per conteggio di fotoni. Per questo motivo, la quantificazione di stechiometrie in campioni vivi, ad esempio, è di gran lunga facilitata. Gli HyD sono disponibili in diversi modelli sia come HyD SP per Imaging multispettro, sia come HyD-RLD per la rilevazione non descansionata in Imaging multifotone e per l'Imaging del tempo di vita della fluorescenza (FLIM).