Laser per microscopia confocale

Sin dal principio, la microscopia confocale ha richiesto sorgenti di luce con elevata luminosità ed un profilo del fascio che può essere facilmente messo a fuoco in un punto limitato alla diffrazione. Questi criteri sono rispettati al meglio dai laser (acronimo per Light Amplification by Stimulated Emission of Light, amplificazione della luce tramite emissione luminosa stimolata), motivo per il quale tutti i microscopi confocali commerciali utilizzano i laser come sorgenti di luce.

In termini di realizzazione tecnica, si possono distinguere diversi tipi di laser. Le classi principali sono rappresentate da laser a semiconduttore, laser a stato solido, laser a gas e laser a fibra. Per semplicità, i laser a semiconduttore saranno considerati anche come laser a stato solido. Leica impiega tutti questi tipi di laser in base alle necessità di applicazione. Di seguito è riportato un riepilogo con i link per ulteriori riferimenti.


Principi generali

 

Il principio comune alla base di tutti i laser è l'emissione stimolata. Questo termine si riferisce ad un tipo di emissione "forzata", ad es. dalla luce, in contrapposizione all'emissione spontanea che è alla base della fluorescenza. L'emissione stimolata necessita
di una (sovrap)popolazione di uno stato quantico eccitato da cui può avere origine l'emissione stimolata
. Nelle normali condizioni di una distribuzione di Boltzmann tra lo stato base e lo stato eccitato, l'emissione stimolata è un processo molto raro. Per questo motivo, i laser richiedono un'inversione dell'equilibrio delle popolazioni, cioè lo stato eccitato deve essere più popolato rispetto alla stato base. Per ottenere questa distribuzione di non equilibrio, l'energia viene trasferita da un livello accoppiato ad energia maggiore, ad es. in un altro materiale, un processo noto come pompaggio. In base alla composizione fisica del laser, il pompaggio può essere ottenuto tramite la luce (pompaggio ottico) o un campo elettrico. I fotoni emessi inducono un'ulteriore emissione che porta ad un'autopropagazione. Per questo motivo i laser producono generalmente una luce coerente (luce in fase poiché emessa nello stesso momento). Come nota a margine, l'emissione stimolata è anche il principio alla base della deplezione per emissione stimolata (STED) applicata alla microscopia a super risoluzione. Un riepilogo generale dei laser utilizzati per la microscopia confocale si trova su Leica Science Lab.

Laser allo stato solido

 

Per definizione, il mezzo del laser (noto anche come mezzo attivo del laser) in un laser a stato solido è un solido (invece del gas, ad esempio). I laser a stato solido sono un tipo diffuso di laser. Il primo laser, infatti, costruito da Theodore Maiman nel 1960, utilizzava come materiale un cristallo di rubino pompato otticamente. Se il pompaggio viene eseguito elettricamente in un semiconduttore, il laser è chiamato diodo laser. Nel caso in cui il pompaggio sia eseguito attraverso la luce (pompaggio ottico), si indica come laser a stato solido pompato otticamente o pompato con un diodo.

Esiste un'ampia varietà di diodi laser disponibili ad un costo ragionevole che li rende ideali per l'Imaging confocale ad un livello iniziale. Nel Leica TCS SP8 sono utilizzati numerosi tipi di laser a stato solido. Sono molto stabili, producono poco calore e perciò non necessitano di raffreddamento. L'unità compatta di alimentazione del Leica TCS SP8 contiene un set di diversi diodi laser e laser a stato solido pompati otticamente ed è poco ingombrante, mentre l'unità flessibile di alimentazione consente di combinare laser a gas con laser a stato solido pompati otticamente, ma richiede più spazio e un migliore sistema di raffreddamento.

Laser a stato solido per lunghezze d'onda superiori a 680 nm

 

Dal lato opposto della scala, sia dal punto di vista tecnico che in termini di lunghezza d'onda, troviamo i laser a femtosecondi a luce pulsata infrarossa come i laser Ti:zaffiro che utilizzano come materiale per il laser cristalli di zaffiro drogati con ioni di titanio (vedere l'immagine su Wikipedia). Con un'emissione regolabile di lunghezze d'onda da circa 680 a 1050 nm, sono utilizzati per l'Imaging multifotone più in profondità nei tessuti dal momento che la dispersione delle lunghezze d'onda maggiori è ridotta. In aggiunta, i laser Ti:zaffiro sono utilizzati per la fotoattivazione e per la microdissezione laser.

Una variante speciale sono gli oscillatori parametrici ottici (OPO), in cui l'intervallo di lunghezze d'onda si estende fino a 1300 nm. Non sono laser di per sé, ma richiedono un laser, di norma un Ti:zaffiro, come laser di pompaggio. Sono utilizzati in microscopia multifotone per l'eccitazione delle proteine fluorescenti rosse o per applicazioni specifiche quali la CARS (Coherent anti-Stokes Raman Scattering, diffusione Raman anti-Stokes coerente) che genera contrasto chimico.

Sia i laser Ti:zaffiro che gli OPO sono laser a impulsi con lunghezze di impulso di circa 70-200 fs. Ciò assicura che le potenze siano abbastanza elevate da produrre effetti a multifotone, mentre la potenza media resti sufficientemente bassa per mantenere la vitalità cellulare.

Ulteriori informazioni sui laser a infrarossi e sulle loro applicazioni si possono trovare negli articoli su Science Lab:

 

 

 

 

 

Laser a gas

 

In questo caso, il materiale del laser è una cavità riempita di gas. A causa della natura delle transizioni energetiche dell'atomo, le linee laser prodotte da un laser a gas sono individualmente monocromatiche generando così il miglior contrasto dell'immagine tra i laser ad onda continua. Alcuni gas, come la miscela di argon e cripton, contengono numerosi livelli energetici che possono agire simultaneamente, generando così una sorgente multilineare da 458 a 514 nm. Nel caso del laser ad argon, il gas viene trasformato in un plasma, ossia in un gas ionizzato a temperatura estremamente elevata e dotato di conduttività elettrica, di cui il Leica TCS SP8 può utilizzare da tre a cinque lunghezze d'onda in base al partitore ottico.

Un altro importante tipo di laser a gas utilizzato con il Leica TCS SP8 è il laser a elio-neon (HeNe). In questo tipo di laser l'elio funziona da mezzo di pompaggio, mentre il neon è il materiale del laser. L'elio è eccitato elettricamente e trasferisce l'energia di pompaggio agli atomi di neon mediante collisioni. I laser HeNe sono impiegati per lo più nell'intervallo arancione e rosso mentre gli HeNe verdi sono stati sostituiti dai più potenti laser a stato solido. Per ulteriore materiale da leggere, consultare l'articolo sul laser a elio-neon su Wikipedia.

Laser a fibra

 

Il termine laser a fibra si riferisce alla struttura del mezzo del laser o di una fibra per la modificazione della luce del laser. Per il Leica TCS SP8 X e il Leica TCS SP8 STED con STED a scansione temporale, vengono impiegati i cosiddetti laser supercontinuum (laser a luce bianca). Il termine supercontinuum si riferisce alla presenza di effetti non lineari nella fibra fotonica che convertono la singola lunghezza d'onda di una sorgente di pompaggio in un ampio spettro. Il laser supercontinuum implementato produce uno spettro bianco liberamente regolabile dai 470 ai 670 nm.

Le sorgenti laser convenzionali forniscono solo una o un numero limitato di linee a singola lunghezza d'onda. Di conseguenza, grosse differenze nello spettro di eccitazione limitano la flessibilità nell'eccitare coloranti non standard e nuove proteine fluorescenti. D'altra parte, le sorgenti luminose come le lampade alogene o ad alogenuri metallici producono un ampio spettro, ma non sono adatte alla microscopia confocale a causa di limitazioni nella luminosità e mancanza di coerenza.

Il laser a luce bianca offre di fatto la flessibilità e le caratteristiche a banda larga della sorgente di una lampada combinata alla luminosità e alla coerenza di un laser. L'implementazione di Leica combina questa sorgente regolabile all'altrettanto regolabile partitore ottico AOBS e alla rilevazione multispettrale. Ciò pone sotto il pieno controllo dell'utilizzatore tutti gli aspetti del processo di fluorescenza, in particolare lunghezza d'onda di eccitazione, selezione della linea, combinazione del colore e banda di rilevazione. La regolazione in tempo reale fino ad otto linee simultaneamente offre letteralmente trilioni di combinazioni per le impostazioni di eccitazione del laser. Poiché il laser a luce bianca è una sorgente ad impulsi, esso può essere anche utilizzato come sorgente flessibile per l'Imaging del tempo di vita della fluorescenza, specialmente per coprire nello spettro la difficile zona verde e quella che va dal giallo all'arancione.

Leica va oltre le applicazioni più consolidate e utilizza le proprietà del laser a luce bianca (WLL) per molte nuove applicazioni. Data la capacità di regolazione nell'ordine di µs, il sistema può registrare spettri di eccitazione-emissione bidimensionali, includendo una dimensione aggiuntiva per la separazione dei fluorocromi e la caratterizzazione delle componenti della fluorescenza di un campione. Inoltre, in combinazione con gli HyD come rilevatori per il conteggio dei fotoni, la fluorescenza può essere separata in diverse componenti tramite un meccanismo di controllo temporale (LightGate). Per questo motivo, ogni canale può fornire più informazioni sulle componenti derivate da riflessione, coloranti fluorescenti e autofluorescenza, in base al relativo tempo di vita della fluorescenza. È possibile sopprimere senza filtri la riflessione e scomporre complesse miscele di specie fluorescenti. In combinazione con i sistemi STED, questa tecnologia di controllo aumenta la super risoluzione al di sotto dei 50 nm. Ulteriori letture sul laser WLL:

  • Per maggiori dettagli su generazione di un supercontinuum, regolazione della lunghezza d'onda, scansioni ad eccitazione-emissione e LightGate, vedere l'articolo su Leica Science Lab di Rolf Borlinghaus e Lioba Kuschel.