Lenti degli obiettivi per Imaging confocale

L'Imaging confocale ha le esigenze più elevate per ciò che concerne le lenti degli obiettivi. Per godere pienamente di tutti i benefici della risoluzione dell'Imaging confocale, il punto focale creato dall'obiettivo deve essere limitato dalla diffrazione per tutto l'intervallo di lunghezze d'onda e tutto il campo visivo. Parametri importanti di un obiettivo per l'Imaging confocale sono l'apertura numerica (NA), la correzione cromatica e l'assenza di rilievi nel campo visivo.


Apertura numerica

L'apertura numerica (NA) determina il potere di risoluzione e la luminosità dell'immagine. È una misura dell'ampiezza e della profondità del punto focale prodotte dall'obiettivo. È definita dal seno dell'apertura angolare a della lente e dall'indice di rifrazione n del mezzo di immersione (Figura 1). In base a questa definizione, maggiore è l'apertura numerica, più stretto sarà il punto focale e di conseguenza maggiore sarà il potere di risoluzione.

Poiché la NA è direttamente proporzionale all'indice di rifrazione n, per NA maggiori di 1 è richiesto un mezzo di immersione con un indice di rifrazione maggiore di 1, cioè diverso dall'aria. NA maggiori richiedono solitamente un disegno più complesso che coinvolge un maggior numero di lenti e una tolleranza più rigida. La Figura 2 mostra un confronto dei fuochi prodotti da obiettivi 40x con diverse NA per mezzo delle loro funzioni di dispersione dei punti(PSF, Point Spread Function).

Figura 1 Definizione dell'apertura numerica (NA). La NA è una misura dell'ampiezza del punto focale. Dipende dal seno dell'apertura angolare alfa e dall'indice di rifrazione n del mezzo di immersione. NA = n • sen alpha (con n=1 per l'aria).

Figura 2 Confronto tra dimensioni di punti focali come funzione dell'apertura numerica. Intensità normalizzate su due coordinate spaziali di un grafico di funzioni di dispersione dei punti calcolate. NA maggiori risultano in un potere di risoluzione più elevato indicato da una dimensione minore del punto.

Correzione cromatica

Una lente ideale dovrebbe mettere a fuoco una sorgente luminosa puntiforme in una PSF ideale le cui dimensioni sono determinate dalla NA dell'obiettivo a dalla lunghezza d'onda della luce. Tuttavia, la forma e la posizione di una reale PSF deviano da una PSF ideale a causa delle imperfezioni di una lente reale. I risultati di tali imperfezioni sono chiamati aberrazioni. Le aberrazioni che causano una forma non ideale della PSF hanno un impatto negativo su risoluzione e contrasto (aberrazione sferica, coma, astigmatismo). Una posizione slittata della PSF risulta in una geometria dell'immagine non ottimale (curvatura, distorsione) o nella sovrapposizione cromatica e di luminosità dell'immagine (aberrazione cromatica nelle direzioni laterali e assiali).

Nell'Imaging confocale ci sono elevate esigenze per il sezionamento in z e l'Imaging multispettro, motivo per il quale le aberrazioni cromatiche e le curvature meritano particolare attenzione. Le aberrazioni cromatiche sono ridotte da speciali disegni di lenti per assicurare che diverse lunghezze d'onda siano messe a fuoco nello stesso punto nelle dimensioni xy e z. Ogni deviazione dall'ideale riduce la qualità degli esperimenti di colocalizzazione nella caratterizzazione funzionale poiché si potrebbero trarre false conclusioni dal corrispondente coefficiente di correlazione. Inoltre, con una migliore correzione cromatica, la luce viene raccolta con più efficienza grazie ad una maggiore sovrapposizione tra le PSF di eccitazione ed emissione (vedere Figura 3).

Figura 3 Illustrazione di come il segnale confocale dipenda dalle aberrazioni cromatiche (computerizzata). Presumendo una lente ideale 63x / 1.40 NA con raggio di Airy ~ 190 nm, foro stenopeico infinitamente piccolo ed eccitazione a 405 nm.

Una classe di obiettivi per la scansione confocale: HC PL APO CS2*

Migliori correzioni per aberrazioni cromatiche, sferiche o di altro tipo si accompagnano all'introduzione di più lenti e richiedono maggiore precisione durante la fabbricazione. Il disegno diventa quindi più complicato la produzione più costosa.

Gli obiettivi sono categorizzati in tre classi in ordine crescente di qualità: Acromatici, semi-apocromatici e apocromatici. Gli apocromatici hanno una correzione del colore per l'intervallo spettrale più ampio. Nella classe degli apocromatici, Leica offre lenti specialmente disegnate per adeguarsi alle specifiche tecniche di più alto livello per la scansione confocale (CS, Confocal Scanning). La più recente serie CS2 è ulteriormente migliorata rispetto alla precedente serie CS e la correzione laterale del colore da poco sviluppata va di pari passo con l'innovativa ottica UV del Leica TCS SP8. L'eccellente correzione del colore degli obiettivi CS2 determina una migliore sovrapposizione del colore specialmente nelle aree periferiche dell'immagine.

*Abbreviazioni:

PL piano, correzione per l'assenza di rilievi del campo

APO apocromatico, correzione del colore per l'intervallo di lunghezze d'onda di rosso, blu e verde

Qui si può trovare un riepilogo più generale delle classi di obiettivi offerti da Leica Microsystems.

Specifico per l'eccitazione con 355 nm: HC PL APO UVIS CS2

Con HC PL APO 63x/1.20 W CORR UVIS CS2 offriamo un un obiettivo a banda ultra larga specifico per l'eccitazione con 355 nm. Fornisce un'eccellente correzione del colore da 345 a 730 nm. Ciò lo rende ideale per la fotoattivazione, per esperimenti di rilascio e fisiologici che utilizzano l'Imaging del Ca2+-singola linea e l'Imaging raziometrico, per il monitoraggio dell'espressione genica o per l'autofluorescenza.

Obiettivi per Imaging multifotone e CARS: HC PL IRAPO

Figura 4 Selezione di obiettivi IRAPO Gli apocromatici a infrarossi sono corretti per l'intervallo del vicino infrarosso dello spettro di lunghezze d'onda. Per questo motivo sono ideali per l'Imaging MP, inclusa l'eccitazione con OPO e CARS.

All'estremo opposto dello spettro di colore è ora disponibile un nuovo set di obiettivi specializzati per migliorare l'Imaging multifotone (MP, Multiphoton). I nuovi IR apocromatici (Figura 4) sono corretti per il colore fino a 1300 nm e altamente trasmissivi nelle lunghezze d'onda del visibile e dell'infrarosso con una trasmissione > 85 % da 470 a 1200 nm: ciò li rende ideali per l'Imaging non lineare come l'Imaging multifotone multicolore inclusa l'eccitazione con OPO (oscillatore ottico parametrico), e CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, diffusione Raman anti-Stokes coerente). Vedere anche la Figura 5.

Figure 5 Riepilogo di diverse correzioni di colore fornite per la microscopia confocale da diversi tipi di obiettivi, CS2, UVIS CS2 e IR APO, rispettivamente. Le rispettive correzioni di colore degli obiettivi IRAPO, PL APO CS2 e PL APO UVIS CS2 sono state ideate per supportare in maniera ottimale specifiche applicazioni, garantendo un'elevata efficienza di colocalizzazione e rilevazione attraverso tutto il campo di scansione. Il grafico mostra la sovrapposizione degli intervalli ottimali (riquadri con linee continue) ed utilizzabili (riquadri con linee tratteggiate) per fornire la copertura completa dell'intervallo di lunghezze d'onda da 355 a 1300 nm. Per l'area verde tratteggiata compresa tra 405 e 450 nm, la correzione del colore è disponibile con alcuni obiettivi CS2. Attraverso la combinazione con l'ottica di scansione ottimale si può ottenere una notevole flessibilità applicativa utilizzando l'obiettivo adatto per ogni esperimento.