Partitori di fascio

Una sfida cruciale nella microscopia a fluorescenza, inclusa la microscopia confocale, è la separazione della luce di eccitazione, ad es. proveniente da un laser, e della luce di fluorescenza emessa dal campione. La luce di eccitazione dovrebbe attraversare il campione senza impedimenti, mentre nessuna parte del campione deve contaminare il segnale di fluorescenza che è più debole di un fattore di 10-5 (vedere Figura 1). Per confronto, questo rapporto è simile all'intensità della luce di una piccola candela rispetto all'intensità di venti lampade alogene da 1000 W. Il partitore di fascio è un componente cruciale per il contrasto dell'immagine nel percorso del raggio per garantire che la fluorescenza sia rilevata senza contaminazione da parte della luce di eccitazione. Per un riepilogo generale dei diversi tipi di partitori di fascio nella microscopia confocale, si prega di fare riferimento al relativo articolo su Leica Science Lab di Rolf Borlinghaus. Di seguito ci si concentrerà su specifici tipi di partitori di fascio utilizzati nel Leica TCS SP8.

Figura 1: Partitore di fascio nella microscopia a fluorescenza. La luce di eccitazione (freccia blu) viene accoppiata nella traiettoria luminosa tramite uno specchio dicroico e trasferita al campione. Parte di essa viene riflessa all'indietro verso il partitore di fascio dove viene bloccata. La maggior parte eccita la fluorescenza (freccia rossa tratteggiata) che attraversa il partitore di fascio per essere rilevata. Si noti la marcata differenza di intensità di cinque ordini di grandezza tra la luce di eccitazione e di emissione.


LIAchroic

I LIAchroic sono una versione avanzata dei partitori di fascio dicroici. Questi ultimi agiscono come uno specchio semi-trasparente selettivo per una lunghezza d'onda, ad es. la luce blu viene riflessa, mentre la verde può attraversarlo. Ciò implica che gli specchi dicroici, come sono anche chiamati, sono selezionati in base allo spostamento di Stokes del colorante fluorescente. Le specifiche proprietà dello spettro di un partitore di fascio sono determinate da un sottile strato di rivestimenti ottici su una base di vetro. I partitori di fascio dicroici sono dei filtri interferenziali. Il rivestimento è fissato per cui, per ciascuna combinazione laser/colorante, è richiesto uno specifico partitore di fascio. Per ottenere ciò, un set di filtri viene di solito posizionato su un cursore mobile o un disco che all'occorrenza entra ed esce dal percorso del fascio. Come mostrato in Figura 1, il disegno tradizionale utilizza un angolo di 45° per lo specchio dicroico, il che comporta dei vantaggi per la separazione geometrica della luce di eccitazione ed emissione essendo i loro fasci ortogonali. Tuttavia, questo disegno non è ugualmente permissivo rispetto ai diversi angoli della luce (lineare) polarizzata. Di conseguenza, una parte della fluorescenza viene persa poiché il relativo piano di polarizzazione assume un orientamento "sbagliato". La spiegazione risiede nel cosiddetto anglo di Brewster. La trasmissione o la riflessione della luce su un'interfaccia aria-vetro dipende dal suo angolo di incidenza. Per le interfacce aria-vetro, l'angolo di Brewster è di circa 56° , troppo prossimo ai 45° normalmente utilizzati per gli specchi dicroici. Qui si possono trovare delle buone visualizzazioni di superfici aria-vetro ad opera di Srihari Angaluri e Kiril N. Vidimce. Quando l'angolo della luce incidente è molto minore di 45°, questo effetto è annullato. Di conseguenza, i partitori di fascio LIAchroic, o dicroici a luce a bassa incidenza, offrono migliore contrasto e sensibilità in confronto ai precedenti partitori di fascio. I LIAchroic sono personalizzati e prodotti in sede per garantire un'efficienza conveniente dei partitori di fascio.

AOBS

Nonostante i recenti progressi nella produzione degli specchi dicroici, restano ancora due svantaggi intrinseci: Trattandosi di filtri, essi perdono sempre una certa quantità di fluorescenza e la loro restrizione ad una determinata lunghezza d'onda limita la flessibilità dello strumento confocale. La perdita di luce nei dicroici avviene non solo a causa della trasmissione minore del 100% oltre la lunghezza d'onda di partizione, ma soprattutto a causa delle caratteristiche del filtro prossimo a tale lunghezza d'onda. Solitamente, i partitori di fascio dicroici trattengono una banda dello spessore di circa 20 nm intorno alla lunghezza d'onda del laser. Poiché questa regione dello spettro spesso contiene il massimo dell'emissione dello spettro di un colorante, si verifica una perdita di luce (vedere Figura 2, area gialla nella riga superiore).

Figura 2: Caratteristiche del filtro di partitori dicroici ottici doppi più vecchi rispetto agli AOBS. Una banda dello spettro intorno alla lunghezza d'onda del filtro teorico viene trattenuta (luce bianca contro luce blu). La fluorescenza che attraversa il filtro viene rilevata (blu scuro-verde), mentre un po' di luce viene persa (giallo). Dato il suo cut-off ripido, l'AOBS raramente risente di questa carenza intrinseca dei partitori dicroici ottici.

Una soluzione al problema è utilizzare un approccio senza filtri per la partizione del fascio. Con il partitore di fascio acusto-ottico (Acousto-Optic Beam Splitter, AOBS), Leica ha introdotto una tecnologia di partizione del fascio che funziona da multiplexer per numerose lunghezze d'onda simultaneamente (Figura 3).

Figura 3: Partitore di fascio acusto-ottico (AOBS). Un cristallo composto da ossido di tellurio (TeO2), omologo del quarzo, funziona da deflettore specifico per una lunghezza d'onda. A questo scopo, un'onda acustica dell'ordine di kHz è accoppiata nel cristallo, modificandone così le proprietà di dispersione. Ciò può essere applicato fino ad otto lunghezze d'onda contemporaneamente tramite la sovrapposizione di numerose frequenze acustiche. Il principio fisico alla base si fonda sulle deformazioni del reticolo cristallino che includono i suoi elettroni. Essi interagiscono con il campo elettrico della luce incidente e la guidano perciò in modo differente a seconda dello spostamento relativo di elettroni.


In pratica, specialmente nell'Imaging multispettro, il cut-off ripido dell'AOBS fornisce una partizione del fascio più efficiente consentendo il rilevamento di una maggiore quantità di luce (Figura 4). Inoltre, utilizzando specchi dicroici, alcune combinazioni di coloranti come ad esempio la marcatura tripla con GFP, YFP e mCherry, non possono essere registrate simultaneamente. Una simile combinazione di filtri non esiste, limitando così la flessibilità sperimentale di combinare liberamente qualsiasi marcatore fluorescente (Figura 5A). Il cut-off ripido dell'AOBS viene nuovamente in aiuto nel soddisfare questo requisito permettendo che anche bande di emissione molto strette siano registrate in parallelo, sostenute dal sensibile sistema di rilevazione del Leica TCS SP8 (Figura 5B). Un esempio di registrazione simultanea di GFP, YFP e mCherry su cellule vive è fornito qui. Sono possibili ancora più combinazioni poiché l'AOBS può essere riprogrammato in microsecondi ad una lunghezza d'onda differente e persino ripartire simultaneamente fino a 8 linee laser. Perciò, la scansione sequenziale lineare fornisce più registrazioni multicanale pseudo-simultanee oltre a quelle simultanee precedentemente descritte. La scansione sequenziale non è possibile con tutte le combinazioni di filtri dicroici in contrasto. Tali proprietà rendono l'AOBS ideale per le impostazioni multi-laser in cui sono possibili 8! = 40320 diverse combinazioni. Ciò è ancora più valido per il laser a luce bianca (WLL2) da cui risultano letteralmente trilioni di combinazioni di eccitazione; è stata realizzata così l'idea di un confocale bianco completamente regolabile.

Figura 4 Efficienza luminosa dell'AOBS. Fila superiore: eccitazione (linee tratteggiate) e spettri di emissione (linee continue) in campioni multicolore con Cy2 (verde), Cy3 (giallo) e Cy5 (rosso), rispettivamente. Le aree di riempimento rappresentano la fluorescenza trasmessa del partitore di fascio dicroico (A) e dell'AOBS (B) ad una trasmissione > 90%. La fluorescenza rilevabile è integrata ed espressa in relazione allo spettro di emissione integrato del relativo colorante (C). L'AOBS trasmette una maggiore porzione della fluorescenza (C, barre rosse) rispetto ai dicroici (C, barre blu).

 

Figura 5: Flessibilità e velocità con l'AOBS. Gli spettri di GFP, YPF e mCherry sono mostrati in verde, giallo e rosso, rispettivamente, come in Figura 4. Nessuna combinazione degli specchi dicroici può registrare simultaneamente la notevole sovrapposizione degli spettri di emissione di GFP e YFP. La sovrapposizione di tipiche bande di lunghezza d'onda di un dicroico è mostrata nell'area di riempimento tratteggiata che non lascia spazio alla necessaria eccitazione a 514 nm. Al contrario, l'AOBS acquisisce entrambi gli spettri in parallelo tenendo conto delle bande di rilevazione molto strette insieme al rilevatore SP e, alternativamente, agli HyD.

Esempio su cellule vive