Scanner del campo visivo

Visualizzazione in una singola ripresa

 

Nonostante i microscopi siano stati inventati per analizzare i piccoli dettagli, è spesso necessario che questi ultimi siano collocati nel contesto giusto. Ciò richiede di visualizzare una regione più ampia del loro ambiente. La dimensione dell'area visibile di un'immagine del microscopio è determinata dal campo visivo (Field of view, FOV) del microscopio. Il FOV di uno strumento confocale è influenzato dalla struttura ottica che consiste di lenti degli obiettivi, ottiche di scansione e scanner. La sfida tecnica per supportare un FOV ampio consiste nell'illuminare uniformemente l'area senza perdere risoluzione dal centro ai bordi.

Illuminazione uniforme in un microscopio confocale a scansione laser

 

Nella versione più semplice di un microscopio a scansione laser si trovano una lente dell'obiettivo OL e uno specchio di scansione MSc (Figura 1). In questo modello, se lo specchio di scansione è leggermente inclinato, il che è necessario per il processo di scansione, la pupilla della lente dell'obiettivo (indicata come un'apertura arancione) non è più completamente riempita. Di conseguenza, i bordi dell'immagine non sono adeguatamente illuminati. Ciò comporta una perdita di intensità e risoluzione.


Figura 1 Oltre all'obiettivo, i sistemi confocali utilizzano di solito anche una lente tubolare TL, posizionata a distanza fTL dal piano retrofocale dell'obiettivo, ed una lente di scansione ScL, posizionata a distanza fScL dal piano retrofocale della lente tubolare, per ottenere l'illuminazione limitata alla sola diffrazione (Figura 2). Se lo specchio di scansione è poi posizionato alla distanza fScL dalla lente di scansione, si parla di "disegno a 4 f”, dal momento che si coprono quattro lunghezze focali f tra l'obiettivo e lo specchio di scansione. Quindi, la pupilla è sempre completamente riempita in tutte le posizioni dello specchio di scansione, risultando nell'illuminazione completa dell'intero campo.

Figura 2: Evitare la vignettatura o la perdita di risoluzione periferica utilizzando un disegno a 4f dello scanner. La lente di scansione (ScL) e la lente tubolare (TL) sono posizionate in modo da coniugare lo specchio di scansione (MSc) alla pupilla posteriore della lente dell'obiettivo (OL).

In un sistema confocale a due specchi di scansione, uno per l'asse x e uno per l'asse y, è necessario fare un compromesso quando si posizionano gli specchi di scansione. Occorre spostare dal piano coniugato uno dei due specchi di scansione o entrambi. Ciò limita il campo utilizzabile poiché si verifica una perdita di intensità e risoluzione verso i bordi del campo.

Al contrario di tutti gli altri scanner confocali, lo scanner Leica X2Y incorporato in Leica TCS SP8 utilizza tre specchi di scansione, uno per l'asse x e due per l'asse y. Il secondo specchio Y dello scanner X2Y garantisce che il punto cardine del fascio luminoso nella pupilla posteriore di OL sia sempre centrato. Con questa disposizione, il disegno a 4f ottimale può essere mantenuto per evitare la vignettatura o la perdita di risoluzione (Figura 3).

Figure 3 X2Y scanner design to maximize field of view by introducing a second Y-galvanometer mirror. The X2Y-system ensures the pivot-plane of the scanning beam is not moving laterally. This avoids image degradation off-center that occurs, when the mirror is not placed in a plane conjugated to the back focal plane.

Gli scanner XY sono limitati nella dimensione del campo, ma con il sistema di scansione X2Y di Leica l'indice di campo è aumentato fino a 22. Ciò equivale ad un quadrato di 1,5 x 1,5 mm2 ad un ingrandimento di 10x. Un campo visivo più ampio consente di far entrare un campione più grande in un'unica immagine o semplicemente di aggiungere un maggiore contesto ad una topologia complessa quale, ad esempio, quella di un campione di tessuto (Figura 4).

Figura 4: Platynereis dumerilii, 2 mesi. Blu: nuclei, DAPI. Verde: tubulina, FITC. Grigio: falloidina, Rodamina. Rosso: serotonina, Cy5. L'intero organismo è compreso in un'unica immagine (FOV). Proiezione massima 3D dell'immagine acquisita con un obiettivo 10x con riduzione massima dello zoom al formato di scansione 5000 x 5000. Campione: per gentile concessione del Dott. Antje Fischer e del Dott. Detlef Arendt, Heidelberg, Germania