Mezzi di immersione per gli obiettivi

Per un'elevata potenza di risoluzione, l'apertura numerica (NA) di un obiettivo deve essere superiore a 1. Ciò richiede che anche il mezzo di immersione abbia un indice di rifrazione superiore a 1, ovvero diverso dall'aria. I mezzi di immersione comuni sono olio, acqua e glicerina. Il mezzo di immersione da utilizzare con un determinato obiettivo è indicato sull'obiettivo.

OIL

Olio di immersione standard DIN/ISO

W

Acqua

GLYC

Glicerina

IMM

Qualsiasi altro o più di un mezzo di immersione

 

 

Tutti gli elementi rilevanti a livello ottico (mezzo di immersione, coprioggetto, campione) davanti alla lente anteriore dell'obiettivo hanno un'influenza significativa sulla qualità dell'immagine. Idealmente, l'indice di rifrazione in tutti questi strati ottici deve corrispondere agli indici di rifrazione per cui è stato progettato l'obiettivo. In realtà, questo risulta difficilmente possibile, in quanto i campioni spesso sono disomogenei, lo spessore del coprioggetto non è così preciso e la temperatura cambia durante l'acquisizione dell'immagine. Questi fattori devono essere considerati quando si sceglie un obiettivo e il mezzo di immersione per una determinata applicazione.

Indici di rifrazione di alcuni importanti mezzi di immersione

Celle in coltura

1,33 - 1,38

Olio tipo F

1,52

Glicerina

1,45 (21 °C) - 1,46 (37 °C) per il liquido di immersione Leica tipo G

Olio di silicone

1,41

Acqua

1,33

100% PBS pH 8,9

1,34

Mowiol

1,46

Balsamo del Canada

1,52

Vetrini coprioggetto

1,52

 

Maggiore è l'apertura numerica dell'obiettivo e più profonde sono le strutture di interesse all'interno del campione, più risulta importante rispettare gli indici di rifrazione del campione e del mezzo di immersione. Indici di rifrazione diversi comportano aberrazioni sferiche e distorsioni geometriche delle strutture. Questo comporta una perdita di contrasto e definizione, oltre a un aspetto delle strutture compresso o allungato.

Olio

 

 

L'indice di rifrazione dell'olio di immersione Leica tipo N e tipo F è 1,518 (a 23 °C e 546 nm), ovvero lo stesso del vetro Crown standard (n=1,518). Per l'Imaging multicolore, anche la dispersione dell'olio di immersione è importante. Spesso viene detta anche numero di Abbe e deve corrispondere al numero di Abbe per il quale è stato progettato l'obiettivo, altrimenti si verificano aberrazioni cromatiche. Ad esempio, l'olio di immersione di tipo N Leica presenta un numero di Abbe di 42,1, mentre l'olio di immersione tipo F presenta un numero di Abbe di 46, valore ottimale per l'Imaging in fluorescenza. Il tipo N non è adatto all'Imaging in fluorescenza.

Gli obiettivi per immersione in olio sono l'ideale per campioni che si trovano in un mezzo corrispondente all'indice di rifrazione dell'olio, ovvero campioni fissati in modo classico inclusi in resina, balsamo del Canada o glicerina-gelatina o che sono elaborati in Imaging vicino al coprioggetto, ovvero a meno di pochi µm. Più lontano dal coprioggetto, luminosità e risoluzione dell'immagine peggiorano rapidamente se gli indici di rifrazione non corrispondono.

Per l'Imaging su cellule vive, ovvero l'Imaging in un campione acquoso, consigliamo vivamente l'uso di immersione in acqua o glicerina.

Gli obiettivi per immersione in olio con aperture estremamente elevate raggiungono le massime prestazioni ottiche solo in un intervallo di temperature relativamente ristretto, in quanto l'indice di rifrazione dell'olio di immersione dipende significativamente dalla temperatura. Più grande è la distanza di lavoro libera, più spesso è lo strato di olio e pertanto maggiore risulta l'impatto delle aberrazioni relative alla temperatura sulla qualità dell'immagine. Questo effetto della temperatura varia linearmente con la distanza di lavoro libera, ma dipende dall'apertura numerica alla quarta.

Per esperimenti a temperature che deviano dalla temperatura ambiente, si consiglia l'immersione in acqua, in quanto l'indice di rifrazione dell'acqua è significativamente meno dipendente dalla temperatura e può essere compensato, visto anche che molti obiettivi per immersione in acqua sono dotati di anello di correzione.

Acqua

 

Gli obiettivi per immersione in acqua sono ottimali per osservare le cellule vive in mezzi acquosi, in quanto gli indici di rifrazione del mezzo di immersione e del campione corrispondono maggiormente rispetto ad esempio all'olio di immersione. Tuttavia, a 37 °C l'acqua evapora rapidamente. Il microdispenser per immersione in acqua Leica aggiunge automaticamente acqua durante l'esecuzione di un esperimento per mantenere un'immersione stabile in acqua.

Glicerina

 

 

Oggi, i campioni maggiormente fissi come cellule in coltura, sezioni tissutali di campioni spessi, oltre a embrioni interi sono montati in Mowiol, Vectashield o miscele simili contenenti acqua e glicerina più diverse sostanze chimiche, come ad esempio sostanze anti-sbiadimento e di preservazione. Questi mezzi possiedono indici di rifrazione vicini a quelli di una miscela 80% glicerina / 20% acqua (n=1,45). Gli obiettivi per immersione in glicerina sono eccellenti per campioni montati in qualsiasi mezzo con un indice di rifrazione che si avvicina a 1,45 - 1,46.

Gli obiettivi per immersione in glicerina offrono un anello di correzione per regolare le ottiche su indici di rifrazione variabili derivanti dalle variazioni di composizione del mezzo di montaggio o dalle variazioni di spessore del coprioggetto o di temperatura. La lettera applicativa n. 17 (aprile 2004) fornisce una descrizione molto dettagliata degli obiettivi per immersione in glicerina e degli effetti di indici di rifrazione non corrispondenti.

Obiettivo per l'uso con immersione di glicerina:

HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2


La maggior parte degli obiettivi multi-immersione (IMM) è utilizzabile per l'immersione in glicerina, oltre che in acqua e olio, come descritto di seguito.

Multi-immersione

 

 

Gli obiettivi adatti per diversi liquidi di immersione, ad es. olio, acqua e glicerina, sono utilizzabili con il mezzo di immersione ottimale per una vasta gamma di campioni.

Obiettivi a multi-immersione:

HC PL APO 10x/0.40 IMM CS
HC PL APO 20x/0.75 IMM CS2