L'evoluzione della risoluzione

Sistema a super risoluzione per la microscopia di localizzazione in 3D Leica SR GSD 3D

La visualizzazione precisa della localizzazione 3D di molecole e strutture è fondamentale per comprendere meglio i processi cellulari. Il microscopio a fluorescenza a campo largo Leica SR GSD 3D con tecnologia GSD (Ground State Depletion, riduzione allo stato fondamentale) o dSTORM (Direct STochastical Optical Reconstruction Microscopy, microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta) permette di eseguire l'imaging in super risoluzione non solo in 2D, ma anche in 3D, con la massima precisione, capacità di riproduzione e risoluzione in microscopia a campo largo possibile finora. Il microscopio Leica SR GSD 3D si basa su un sistema TIRF completamente automatizzato. In qualità di sistema multifunzione, offre ai ricercatori la libertà di adattare il sistema alle specifiche applicazioni di imaging su cellule vive o in fluorescenza avanzata.

Ricostruzione 3D di un angolo di cellula endoteliale umana (Huvec) colorata per mostrare la vimentina con Alexa 647 Ab. Mezzo: tampone simil-gloxy. Per gentile concessione di K. Jalink e L. Nahidi Azar, Amsterdam, Paesi Bassi.
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Localizzazione attendibile e massima risoluzione in x, y e z

Definizione di nuovi standard per precisione, stabilità e prestazioni ottiche

Con la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (GSD o dSTORM), è possibile ottenere immagini in super risoluzione con una risoluzione laterale fino a 20 nm. Tuttavia, la risoluzione z di un microscopio a campo largo è ancora limitata a circa diverse centinaia di nanometri. Leica Microsystems, pioniera della microscopia a super risoluzione, ha sviluppato il microscopio Leica SR GSD 3D per superare questo limite e raggiungere una risoluzione di 50 nm in direzione assiale, per definire nuovi standard di precisione della localizzazione 3D.

Il microscopio Leica SR GSD 3D è lo strumento perfetto grazie alla sua precisione unica per la localizzazione di singole molecole, la sua stabilità di sistema, le prestazioni ottiche e il pratico utilizzo. Queste caratteristiche sono essenziali per poter ottenere risultati riproducibili e di alta qualità, nel minor tempo possibile. Tutti i componenti ottici sono corretti apocromaticamente secondo rigidi standard Leica Microsystems. Il software permette la calibrazione precisa e, oltre alla calibrazione standard con microsfere d'oro, sono disponibili calibrazioni specifiche per colore con microsfere di fluorescenza o molecole di colorante del campione.

Oltre ai noti vantaggi...

Risoluzione laterale massima fino a 20 nm

Basato sulla tecnologia GSDIM, il nuovo Leica SR GSD 3D supera i limiti di risoluzione precedentemente stabiliti da altri sistemi a super risoluzione. GSDIM e STED sono sistemi brevettati da Stefan Hell del Max Planck Institute Göttingen, Germania, concessi in licenza esclusiva a Leica Microsystems.

Proiezione dell'immagine in super risoluzione online: osservazione dei risultati durante l'acquisizione

Il sistema Leica SR GSD 3D offre la proiezione dell'immagine online in super risoluzione. Durante l'acquisizione, l'utente vede la creazione delle immagini online. Questa caratteristica permette all'utente di avere pieno controllo sull'esperimento, potendo decidere di fermare l'acquisizione dell'immagine o di proseguire fino a raggiungere un risultato soddisfacente.

Massima flessibilità di applicazione offerta dalla combinazione di super risoluzione con TIRF ed epifluorescenza su un sistema di imaging su cellule vive multiuso

La stazione di lavoro consente all'utente di realizzare esperimenti ogni giorno, dall'imaging ad alta velocità fino al time-lapse e alla fluorescenza TIRF, allargando al tempo stesso il proprio campo d'azione dell'imaging nella sfera della super risoluzione.

È possibile utilizzare un fluorocromo standard, senza modificare i protocolli esistenti

Il flusso di lavoro della tecnologia GSD si basa su tecniche di immunocolorazione standard e si integra perfettamente nei flussi di lavoro di microscopia a fluorescenza preesistenti.

... abbiamo ridefinito i limiti della super-risoluzione

aggiungendo la dimensione Z

Massima stabilità del laser, autofluorescenza minima e massima correzione del colore

Obiettivo ad alta potenza appositamente progettato per la super risoluzione

Il microscopio Leica SR GSD 3D è dotato di un obiettivo ad alte prestazioni da 160x, sviluppato appositamente per la microscopia a super risoluzione. La sua struttura è ottimizzata per emissioni laser ad alta potenza. L'autofluorescenza estremamente ridotta garantisce un rapporto segnale-rumore elevato, ideale per applicazioni di rilevamento di singole molecole. La straordinaria correzione apocromatica migliora ulteriormente i risultati dell'immagine.

Localizzazione precisa con un obiettivo cilindrico nel percorso di emissione del raggio

Il principio di localizzazione 3D con l'approccio dell'astigmatismo

Per la localizzazione di singole molecole nella microscopia a fluorescenza GDSIM o dSTORM, viene registrata la funzione PSF (Point Spread Function, funzione di dispersione dei punti) e si esegue un adattamento per determinare la posizione del fluoroforo. Con un comune microscopio a fluorescenza, la posizione laterale del fluoroforo è definita dalla normale funzione PSF (sinistra). Se a questo sistema viene aggiunto un obiettivo cilindrico, si ottiene una funzione PSF (astigmatismo) diversa (destra). Le immagini corrispondenti permettono di determinare la posizione z di una molecola rilevata, permettendo così la ricostruzione 3D.

Per garantire la riproducibilità dei risultati, l'obiettivo viene posizionato con precisione sul percorso di emissione del raggio non appena il sistema passa dalla registrazione 2D a quella 3D, non manualmente, bensì automaticamente con un solo clic del mouse mediante comando del software.

Il tavolino SuMo riduce al minimo la deriva per una localizzazione precisa delle molecole

Zero compromessi per precisione e stabilità

Il tavolino SuMo Leica Microsystems introduce una nuovissima tecnologia di compensazione della deriva, che pone in secondo piano la deriva massima del sistema rispetto alla risoluzione durante l'acquisizione. Questo rende possibile l'osservazione dell'immagine in super risoluzione mentre viene acquisita. La speciale tecnologia SuMo (SUpressed MOtion, movimento frenato) non solo garantisce la minima deriva, ma anche la massima stabilità durante il rilevamento.

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