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Leica TCS SP8 STED

透明化した成人腎臓検体の 45~65 µm深部ナノ顕微鏡像20 µm xyz スタック共焦点/3D STEDネフリン可視化:STAR 635P. 透明化:修正 CLARITY プロトコルSTED レンズ:HC PL APO 93X/1.30 GLYC motCORR – STED WHITE。試料提供:David Unnersjö-Jess 氏(スウェーデン王立工科大学)

STED イメージングから始めますか?

生体の細部に迫るために新たな投資は必要ありません。新しいライカ TCS SP8 STED ONE 592 および STED ONE 660 ナノ顕微鏡は、多彩な機能を持つ革新的な共焦点プラットフォームであるライカ TCS SP8 を基礎とするナノ顕微鏡法ストラテジーの第一歩となります。ライカ マイクロシステムズの STED ナノ顕微鏡は、ライカ HyD ハイブリッドディテクターの感度とホワイトライトレーザーによる自由な励起との組み合わせでスペクトルを検出し、ナノ顕微鏡観察に限られない高い自由度を持っています。

できるだけ多くの蛍光試薬と色素を利用したい場合、ライカ TCS SP8 STED 3X では最大 3 つの STED レーザーラインを使用することができ、可視光全域にわたる STED が容易になります。

研究力を強化するテクノロジー

  • x、y、z 各方向に調節可能な直接ナノ顕微鏡法で超微細な構造を観察
  • スペクトル全域にわたり最適の色収差補正を行う STED WHITE 対物レンズ
  • 深部ライブイメージング向けの motCORR STED 対物レンズ
  • マルチ STED レーザーラインによるフルスペクトル超解像イメージング
  • ゲート検出により、さらに分解能を向上し、ライブセルイメージングを可能に
  • 自動ビームアライメント機能による、安定した信頼性ある超解像イメージング
  • Smart STED ウィザードにより、画像取得のセットアップを直観的にコントロール
  • Huygens デコンボリューションにより、超解像イメージングの質をさらに向上
  • TCS SP8 ベースのモジュラーコンセプトにより、システムのアップグレードがいつでも可能

「STED 3Xは 飛躍的進歩を遂げ、新しい次元を切り拓きました。細胞のマルチカラー超解像イメージングは、細胞生物学に必ずや革命をもたらすでしょう。」

岡田康志博士(理研生命システム研究センター)

「R&D 100 Award 2014」と「Scientist Top 10 Innovations Award 2014」において、ライカ TCS SP8 STED 3X が 2014 年に発売された最も注目すべきハイテク製品の一つに選ばれました。
Hela 細胞の三重免疫染色 STED 画像。緑:NUP153-Alexa 532、赤:Clathrin-TMR、白:Actin-Alexa 488

マルチカラーナノ顕微鏡法

フルスペクトル可視光を網羅

マルチカラーアプリケーションによって、さまざまな組織が織りなす相互関係について、詳細に情報を得ることができます。コローカリゼーションは日常的に STED ONE ナノ顕微鏡を用いて行われています。STED 3X のマルチ STED レーザーライン(592 nm、660 nm) および分解能が 30 nm 以下に達するパルスレーザー (775 nm) によって、可視光の全スペクトルがカバーされ、多数の蛍光試薬が利用できることになります。

色数が増えれば、見える景色が変わります!

ホワイトライトレーザー、AOBS(音響光学ビームスプリッター)および調節可能なスペクトル検出器の相乗作用によって、蛍光試薬のどのような組み合わせのイメージングも可能になり、マルチカラー実験の自由度を飛躍的に高めます。

「私にとっての STED の意義は本質的に重要な細部が見られることです」

Stephan Sigrist 教授(ベルリン自由大学、ドイツ)

最新技術に支えられるナノ顕微鏡法

STED WHITE - 妥協のない光学系

極微の細部を高分解能で見るには、まず最良の光学系を用意しなければなりません。2 つの STED WHITE 対物レンズの優れた色収差補正により、励起と z 方向の STED PSF との最適なオーバーレイが可視光スペクトルの全域にわたって保証されます。STED の励起光源として 592/660/775 nm のホワイトライトレーザーを用いることができ、従来より多様な蛍光試薬を自由に選択することが可能です。

生細胞ナノ顕微鏡観察のための STED 対物レンズ

STED WHITE油浸対物レンズ (HC PL APO 100x/1.40 OIL) を用いれば、標準的な固定試料のイメージングが容易です。このレンズで最大の開口数と分解能が得られます。より複雑な実験のためには、新しい STED WHITE グリセリン浸対物レンズ (HC PL APO 93X/1.30 GLYC motCORR) が新しい機会を提供します。カバーグラスの厚さや温度の変化、試料の不均一性などに対しても電動式補正環によりレンズの調節が正確・迅速に行えます。3D STED により、室温だけでなく 37°C においても、試料の深部の微細構造に光を当てることができます。

"The lens is a must, everybody should have it!" - Dr. Yasushi Okada, RIKEN Quantitative Biology Center, Osaka, Japan

"The new 93x STED objective with glycerol immersion opens up a new range of applications that are important for biological imaging." - Timo Zimmermann, Center for Genomic Regulation, Barcelona, Spain

STED WHITE 対物レンズの色収差。灰色破線・実線は焦点深度を示す。

Gated STED - 生細胞ナノ顕微鏡観察への第一歩

生細胞のイメージング:麻酔下ショウジョウバエの幼虫の体表から約 10 µm の深さの部位にある軸索に沿って移動する有芯小胞。ANF GFP で標識。画像は共焦点、STED ともに 0.45 秒間隔で撮影。上の動画は TrackMate(FiJi)による細胞トラッキング結果

gSTED - より精細な画像をより多く

Gated STED は定評ある STED CW の機能を大きく拡張したもので、分解能を向上させ、あるいはレーザー出力を下げることが可能になります。

より多くの画像データが得られ、より精細な観察ができます。

「事実 g-STED はこれまで報告されているすべての STED モダリティのうちで最も鮮明な画像をもたらし、かつピーク出力が最も小さい」

Vicidomini et al., Nature Methods 2011

懸濁液中の生きた T 細胞。共焦点および STED スタックの 3D 再構築。マキシマムプロジェクション。提供:Marco Fritsche, Mathias Clausen, Christian Eggeling 氏(オックスフォード大学 MRC Human Immunology Unit, Weatherall Institute of Molecular Medicine、イギリス)

HyD とホワイトライトレーザーで 50 nm 以下に至る分解能

HyD™ ハイブリッドディテクターと、パルス励起光源としてのホワイトライトレーザーと組み合わせると、シグナルの検出を励起パルス後の一定のタイムゲート内のみに限定することができます。タイムゲートを励起パルスから遠ざかる方向にシフトすることで、50 nm を大きく下回る分解能を得ることができます。Gated STED では STED CW に比べて、同じレーザー出力で 50% 以上高い分解能が得られます。STED 光出力を増加させることなく、より微細な構造が観察でき、生細胞観察の可能性が拡充されます。

STED CW 顕微鏡のフォーカルスポットにおける蛍光分子の寿命の分布。長寿命の状態(赤)は中心部に、短寿命の状態(青)は周辺部に存在しています。

第三の次元での STED

複数の STED 光路

TCS SP8 STED 3X および TCS SP8 STED ONE を用いると、異なる STED パターンを生ずる 2 つの光路を利用することができます。

PSF を自在にデザインする

最適な結果を得るため、平面分解能最大から垂直(Z 軸)分解能最大に至る、任意の設定を選択できます。超薄の光学切片は未知のディテールを明らかにします。STED 3X および STED ONE により、お使いの顕微鏡の分解能をすべての次元において研究課題と試料とに適合させることが可能になります。

「STED イメージングに第三の次元と新たな STED ラインを追加したことで、これまで見えなかったものが見えるようになりました」

Timo Zimmermann博士(バルセロナ遺伝子制御センター、スペイン)

Z スタック(91 スライス)を Huygens デコンボリューション処理した後、レンダリングにより 3D 再構築した表面。STED による平面分解能最大化(背面の緑)または全次元での分解能最大化(前面の緑)を行ったときの STED データ(緑)を、共焦点顕微鏡で得られた結果(赤)と比較すると、分解能の向上がはっきりとわかります。観察される組織について最善の画像が獲得されるのは、明らかに 3D STED によってです。

分解能の選択

2 つの STED 光路への光の割り当てによる分解能向上:最大の平面分解能は従来のボルテックスドーナツにより、最大の垂直分解能は新しい z ドーナツにより、それぞれ達成されます。またフォーカルボリュームを最小にするように最適化することも可能です。

STED のためのソフトウェアソリューション - 分解能を知る

STED 顕微鏡は超解像への最短の近道です。LAS X は最大の利便性を提供するソフトウェアです。技術的パラメータの選択の影響を直接に可視化するオンラインのフィードバックとして、有効点像分布関数(PSF)の予測模式図が表示されます。

直観的ワークフロー

Smart STED ウィザードを利用すれば、3 つのスライダーによって簡単に装置の制御ができます。有効 PSF の模式図を手がかりに、必要な分解能の全体的レベルを決定します。ウィザードでは、STED レーザーパワー、画素サイズ、z ステップ幅、ピンホール、ゲート設定、画像平均化など、最適な結果を得るうえで必要なあらゆる設定を調節できます。

強力な Huygens STED デコンボリューション

TCS SP8 STED 3X システムには SVI 社の強力な Huygens STED デコンボリューション パッケージが付属します。Huygens はコントラストを劇的に改善し、x、y、z 方向の分解能も向上させます。結果は RAW データと直接比較できます。画像処理に起因するアーティファクトに惑わされる心配はありません。

「3 次元での STED イメージングができることで私たちの研究は次のレベル、すなわち研究者のニーズの核心へ進めるでしょう。」

Christian Eggeling 博士(オックスフォード大学、イギリス)

Smart STED によるワークフロー:1. 希望する有効 PSF をSTED および 3D スライダーで設定します。2. SN 比と画像数をドーセージスライダーで選択します。3. 共焦点ライブスキャンをして観察領域を決定し、励起条件を調整します。4. 1 枚の画像を取り込み、または連続撮影を開始して、超高分解能データを取得します。