FLIM 측정은 Leica TCS SMD FLIM 시스템으로 수행됩니다.

형광 수명의 정의

형광 수명이란 형광단이 형광 광자를 방출함으로써 기저 상태로 되돌아가기 전에 평균적으로 얼마나 오랫동안 여기 상태로 남아있는지를 나타내는 측정값입니다. 형광단으로부터의 형광 광자 방출이 지정된 시간에 발생하는 것이 아닙니다. 대신에, 시간 분포를 살펴보면, 이를 지수감쇠함수로 설명할 수 있습니다. 이 감쇠의 특성시간 상수, 즉 형광 수명은 수 조분의 1초(10-12 s) ~ 수 100억분의 1초(10-9 s)의 시간대역을 가집니다.

나노환경 지표로서의 형광 수명

이 수명은 마이크로-주변(micro-surrounding) 또는 그 구조 상태(conformational state)에 의해 변화하는 형광체가 나타내는 특징적 파라미터입니다. 형광수명 정보는 이러한 물질구조의 분자적 환경, 예를 들면 이온농도, pH, 지질친화성 및 다른 분자와의 결합 등의 지표가 됩니다.

수명 측정과 이미징의 결합

FLIM는 수명 측정과 이미징이 결합되었습니다: 픽셀수준에서 얻어진 수명은 이미지로 만들기 위해 색코드로 분류됩니다. 그러므로, FLIM는 형광 분자의 공간적 분포에 대한 정보와 함께 그 나노환경에 대한 정보도 전달합니다. 이런 방식으로 추가 정보차원이 얻어집니다.

FLIM 데이터 획득 및 분석의 원리

  1. 각 픽셀에서 레이저 펄스와 형광 광자 간의 시간을 반복 측정
  2. 광자 수 나누기 레이저 펄스 후 도착 시간의 수분포도 계산
  3. 각 도수분포도에 지수감쇠를 대입. 진폭은 광자의 총 수를 반영하고, 시간상수 τ는 형광 수명이라고 일컬어짐
  4. 색 정의표(false-color look-up table)를 이용하여 수명 이미지를 표시
FLIM Data acquisition and analysis, step 1
Step 4
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