Meio de imersão para objetivas

Para alta potência de resolução, a abertura numérica (NA) de uma objetiva precisa ser maior que 1. Isso também requer um meio de imersão com um índice de refração maior que 1, ou seja, diferente de ar. Os meios de imersão comuns são: óleo, água e glicerina. O meio de imersão que deve ser utilizado com uma determinada objetiva é indicado na objetiva.

ÓLEO

Óleo de imersão padrão DIN/ISO

W

Água

GLYC

Glicerina

IMM

Qualquer outro ou mais de um meio de imersão

 

 

Todos os elementos opticamente relevantes (meio de imersão, lamínula, amostra) na frente da lente da objetiva têm uma influência importante na qualidade da imagem. De modo ideal, o índice de refração ao longo de todas essas camadas ópticas deve ser compatível com os índices de refração para o qual a objetiva foi concebida. Na realidade, isso é raramente possível, pois as amostras geralmente são heterogêneas, a espessura da lamínula não é tão precisa e a temperatura muda durante a aquisição da imagem. Esses fatores devem ser sempre considerados ao escolher uma objetiva e o meio de imersão para uma determinada aplicação.

Índices de refração de alguns meios de imersão importantes

Células cultivadas

1,33 – 1,38

Óleo tipo F

1,52

Glicerina

1,45 (21 °C) – 1,46 (37 °C) para líquido de imersão Leica tipo G

Óleo de silicone

1,41

Água

1,33

100% PBS pH 8,9

1,34

Mowiol

1,46

Bálsamo do Canadá

1,52

Lamínulas

1,52

 

Quanto maior a abertura numérica da objetiva e mais profundas as estruturas de interesse no interior da amostra, mais importante será compatibilizar os índices de refração da amostra e o meio de imersão. Diferentes índices de refração levam a aberrações esféricas e distorções geométricas das estruturas. Isso resulta em uma perda de contraste e definição, bem como estruturas com aparência comprimida ou alongada.

Óleo

 

O índice de refração do tipos N e F de imersão em óleo da Leica é de 1,518 (a 23 °C e 546 nm), ou seja, o mesmo que o vidro da coroa padrão (n=1,518). Para a aquisição de imagens multicolorida, a dispersão da imersão em óleo também é importante. Esse valor, normalmente chamado de número Abbe, deve corresponder ao número Abbe da objetiva para a qual foi concebida, ou ocorrerão aberrações cromáticas. Por exemplo o tipo N de imersão em óleo da Leica tem um número Abbe de 42,1, enquanto que o tipo F de imersão em óleo tem um número Abbe de 46, ideal para imagens de fluorescência. O tipo N não é adequado para imagens de fluorescência.

As objetivas de imersão em óleo são ideais para amostras que em um meio que corresponde ao índice de refração do óleo, ou seja, amostras incluídas em resina, bálsamo do Canadá ou glicerina-gel, ou que são geradas imagens perto da lamínula, ou seja, menos de poucos µm. Mais longe da lamínula, o brilho e a resolução da imagem se deterioram rapidamente, se o índice de refração não for compatível.

Para a geração de imagens ao vivo, ou seja, imagem em uma amostra aquosa. recomendamos enfaticamente o uso de imersão em água ou glicerina.

As objetivas de imersão em óleo com aberturas extremamente altas só proporcionam seu desempenho óptico pleno em um intervalo de temperatura relativamente estreito, visto que o índice de refração do óleo de imersão depende muito da temperatura. Quando maior a distância livre de trabalho maior a espessura da camada de óleo e, portanto, maior será o impacto das aberrações relacionadas à temperatura na qualidade da imagem. Esse efeito da temperatura muda linearmente com a distância livre de trabalho, mas depende da abertura numérica à potência de quatro.

Para ensaios em temperaturas que se desviam da temperatura ambiente, recomenda-se a imersão em água, uma vez que o índice de refração da água é significativamente menos dependente da temperatura é pode ser compensado, visto que as objetivas de imersão em água possuem anéis de correção.

Água

 

As objetivas de imersão em água são ideais para a observação de células vivas em meio aquoso, pois o índice de refração do meio de imersão e a amostra são uma correspondência mais próxima do que o óleo de imersão, por exemplo. No entanto, a água se evapora rapidamente a 37 °C. O Leica Water Immersion Micro Dispenser (microdistribuidor de imersão em água) automaticamente adiciona água durante um ensaio em execução para fornecer imersão em água estável.

Glicerina

 

Hoje em dia, a maioria das amostras fixadas como células cultivadas, fatias de tecido de amostras grossas, bem como embriões integrais são montados em Mowiol, Vectashield ou misturas semelhantes contento água e glicerina além de diversos produtos químicos, por exemplo, substâncias de preservação e antidesbotamento. Esses meios possuem índices de refração próximos ao de uma mistura de glicerina/água a 80%/20% (n=1,45). As objetivas para glicerina são excelentes para amostras montadas em qualquer meio com um índice de refração próximo de 1,45 – 1,46.

As objetivas Leica para imersão em glicerina oferecem um anel de correção para ajustar a óptica aos índices de refração variáveis provenientes de alterações da composição do meio de montagem ou de variações da espessura da lamínula ou da temperatura. <media 722 – - "TEXTO, Carta de aplicação 17, objetiva para glicerina a 144 dpi, Appl_Let_17_Glycerol_Objective_144dpi.pdf, 1.3 MB">A carta de aplicação nº 17 (abril de 2004)</media> mostra uma descrição bastante detalhada das objetivas para imersão em glicerina e os efeitos das incompatibilidades do índice de refração.

Objetiva para uso com imersão em glicerina:

HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2


Em sua maioria, as objetivas de multi-imersão (IMM) podem ser usadas para imersão em glicerina, bem como em água e óleo, conforme descrito abaixo.

Multi-imersão

 

Objetivas adequadas para uso com vários líquidos de imersão, ou seja, óleo, água e glicerina, podem ser usadas com o meio de imersão ideal para uma grande variedade de amostras.

Objetivas multi-imersão:

HC PL APO 10x/0.40 IMM CS
HC PL APO 20x/0,75 IMM CS2