Método de espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS)

A FCS é um método de medição baseado em fluorescência. As moléculas fluorescentes que passam através de um feixe de laser fixo, fortemente focado, são excitadas para emissão de fluorescência. Depois de passar por um pequeno orifício confocal, os fótons emitidos são registrados usando detectores muito sensíveis.

As medições de FCS são realizadas com o sistema Leica TCS SP8 SMD.


Parâmetros quantitativos são obtidos a partir da curva de autocorrelação

As partículas em movimento dão origem a flutuações de intensidade. Uma autocorrelação revela informações sobre a escala molecular: a amplitude da curva de correlação mostra o número de partículas. O tempo no ponto de reflexão contém informações sobre a mobilidade das partículas. Por fim, a declividade e a forma da curva refletem o tipo de difusão. A concentração de partículas, a massa da partícula, a viscosidade e a fração de ligação podem ser obtidas a partir desses parâmetros.

Princípios da aquisição de dados e análise de FCS

  1. A iluminação a laser em um ponto fixo de interesse (estacionamento do feixe) excita partículas fluorescentes no volume de excitação. O movimento das partículas entrando e saindo do volume confocal causa flutuações de intensidade.
  2. Registro de flutuações de intensidade usando detectores no modo de contagem de fóton individual.
  3. Cálculo da função de correlação.
  4. Adaptação do modelo biofísico correspondente à curva de correlação. Obtenha parâmetros de interesse:

    • concentração de partículas
    • coeficiente de difusão
    • viscosidade
    • massa molecular
    • constante de ligação
    • propriedades fotofísicas