As medições de FLIM são realizadas com o Leica TCS SP8 SMD com configuração FLIM.

Definição do tempo de vida de fluorescência

 

O tempo de vida da fluorescência é uma medida de quanto tempo, em média, um fluoróforo permanece em estado de excitação antes de retornar ao estado original , emitindo um fóton de fluorescência. A emissão de um fóton de fluorescência de um fluoróforo não ocorre em um tempo fixo. Em vez disso, uma distribuição de tempos é observada, que pode ser descrita por uma função de decaimento exponencial. A constante de tempo característica desse decaimento, o tempo de vida de fluorescência, está no intervalo de alguns picossegundos (10-12 s) a vários décimos de nanossegundos (10-9 s).

Tempo de vida de fluorescência como investigação para nanoambiente

 

Esse tempo de vida é um parâmetro característico de cada corante fluorescente que pode se alterar em função do microambiente ou do estado conformacional. As informações do tempo de vida investigam o ambiente molecular quanto à sua composição, como a concentração iônica, o pH, a lipofilicidade ou a ligação com outras moléculas.

Combinação de medida do tempo de vida e aquisição de imagens

 

O FLIM combina medições do tempo de vida com a aquisição de imagens: os tempos de vida obtidos em nível de pixel são codificados por cor para produzir imagens. Assim, o FLIM fornece informações sobre a distribuição especial de uma molécula fluorescente em conjunto com informações sobre o seu nanoambiente. Dessa forma, obtém-se uma dimensão adicional de informações.

Princípios da aquisição de dados e análise de FLIM

  1. Medições repetidas do tempo entre o pulso de laser e o fóton de fluorescência em cada pixel.
  2. Cálculo de um histograma de contagens de fótons ao longo do tempo de chegada após o pulso de laser.
  3. Adaptação de um decaimento exponencial para cada histograma. A amplitude reflete o total de fótons, a constante de tempo τ é chamada de tempo de vida fluorescência.
  4. Exibição da imagem do tempo de vida usando uma tabela de pesquisa de cores falsas.
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