Lasers para microscopia confocal

Desde sua criação, a microscopia confocal tem exigido fontes de luz com alto brilho e um perfil de feixe que é facilmente focado em um ponto de difração limitada. Esses critérios são mais bem atendidos por lasers (sigla de Light Amplification by Stimulated Emission of Light, Ampliação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação), razão pela qual todos os microscópios confocais comerciais usam lasers como fontes de luz.

É possível distinguir diferentes tipos de lasers em termos de realização técnica. As classes importantes são: laser semicondutores, lasers de estado sólido, laser a gás e lasers de fibra. Para simplicidade, os lasers semicondutores também devem ser vistos como lasers de estado sólido. A Leica emprega todos esses tipos de lasers, dependendo das exigências da aplicação. Os itens a seguir fornecem uma visão geral com links para mais consultas.


Princípios gerais

 

O princípio subjacente comum a todos os lasers é a emissão estimulada. Esse termo refere-se a um tipo de emissão "forçada", por exemplo, pela luz, em oposição à emissão espontânea, que é a base para a fluorescência. A emissão estimulada requer
a (super)população de um estado quântico excitado a partir do qual a emissão estimulada pode ocorrer
. Em condições normais de uma distribuição de Boltzmann entre o estado mais estável e o estado excitado, a emissão estimulada é um processo muito raro. Assim, os lasers requerem uma inversão da população de equilíbrio, ou seja, o estado excitado deve ser preenchido mais do que o estado mais estável. A fim de alcançar essa distribuição de não equilíbrio, a energia é transferida a partir de um nível de energia mais elevado acoplado, por exemplo, em outro material, um processo conhecido como bombeamento. Dependendo da construção física do laser, o bombeamento pode ser obtido pela luz (bombeamento óptico) ou por um campo elétrico. Os fótons emitidos induzem mais emissão que leva à autoampliação. Portanto, os laser geralmente produzem luz coerente (a luz estando em fase, desde que seja emitida ao mesmo tempo). Como uma observação à parte, a emissão estimulada também é o princípio subjacente da depleção da emissão estimulada (STED) aplicada à microscopia de superresolução. Uma visão geral dos lasers usados para microscopia confocal pode ser encontrada no Laboratório de Ciências da Leica.

Laser de estado sólido

 

Por definição, o meio de emissão do laser (também conhecido como meio de ativação do laser), em um laser de estado sólido, é um sólido (em oposição a um gás, por exemplo). Os lasers de estado sólido são um tipo de laser consagrado. De fato, o primeiro laser, criado por Theodore Maiman em 1960, usava um cristal de rubi bombeado opticamente como o material de emissão do laser. Se o bombeamento for feito eletricamente em um semicondutor, o laser é chamado de laser de diodo. No caso de bombeamento feito por luz (bombeamento óptico), é conhecido como um laser de estado sólido bombeado por diodo ou bombeado opticamente.

Há uma grande variedade de lasers de diodo disponíveis a um preço razoável, o que os torna ideal para a aquisição de imagens confocais em nível de entrada. Vários tipos de lasers de estado sólido são usados no Leica TCS SP8. Eles são muito estáveis, produzem apenas pouco calor e, portanto, não precisam de refrigeração. A Unidade de Suprimento Compacta do TCS SP8 contém um conjunto de lasers de diodo diferentes e laser de estado sólido bombeados opticamente, e oferece uma base pequena, enquanto a Unidade de Suprimento Flexível permite combinar lasers a gás com lasers de estado sólido bombeados opticamente, mas requer mais espaço e melhor refrigeração.

Laser de estado sólido para comprimentos de onda superiores a 680 nm

 

No extremo oposto da escala, tanto tecnicamente quanto em termos de comprimento de onda, se encontram os lasers infravermelhos pulsados em femtossegundo, como os lasers Ti:Sapphire utilizando titânio titulado com cristais de safira como material de emissão do laser (veja a fotografia na Wikipedia). Com seus comprimentos de onda ajustáveis de cerca de 680 a 1050 nm, são usados para a aquisição de imagens multifotônicas mais profundas nos tecidos visto que a dispersão de comprimentos de onda mais longos é reduzida. Além disso, os lasers Ti:Sapphire são utilizados para fotoativação e microdissecção a laser.

Uma variante especial são os osciladores paramétricos ópticos (OPO), que aumentam o intervalo de comprimento de onda para 1.300 nm e mais. Eles não são lasers em si, mas requerem um laser, geralmente Ti:Sapphire, como laser de bomba. Na microscopia multifotônica, são usados para a excitação de proteínas fluorescentes vermelhas ou para aplicações específicas, como CARS que produzem contraste químico.

Tanto os lasers Ti:Sapphire como os OPOs são lasers pulsados com comprimentos de pulso ao redor de 70-200 fs. Isso garante que as potências de pico sejam suficientemente altas para produzir efeitos multifotônicos, mas a potência média ainda é suficientemente baixa para manter a viabilidade celular.

Mais informações sobre lasers infravermelhos e suas aplicações podem ser encontradas nos seguintes artigos do Laboratório de Ciências:

Lasers a gás

 

Aqui, o material de emissão do laser é uma cavidade preenchida com gás. Devido à natureza das transições da energia atômica, as linhas de laser produzidos por um laser a gás são particularmente monocromáticas, fornecendo assim o melhor contraste de imagem dos lasers de onda contínua. Alguns gases como a mistura de argônio e criptônio possuem vários níveis de energia, que podem ser emitidos simultaneamente, fornecendo assim uma fonte multilinha de 458 a 514 nm. No caso do laser de argônio, o gás é transformado em um plasma, ou seja, gás ionizado superaquecido com condutividade elétrica, do qual o Leica TCS SP8 pode utilizar de três a cinco comprimentos de onda, dependendo do divisor de feixe.

Outro tipo importante de lasers a gás usado com o Leica TCS SP8 é o laser de hélio-neônio (HeNe). Nesse tipo de laser, o hélio funciona como o meio da bomba, enquanto o neônio é o material de emissão do laser. O hélio é excitado eletricamente e transfere a energia da bomba para os átomos de neônio por colisões. Os lasers HeNe são mais empregados na faixa laranja e vermelha, enquanto os HeNes verdes foram substituídos por lasers de estado sólido mais potentes. Para leitura adicional, consulte o artigo sobre laser de hélio-neônio na Wikipedia.

Lasers de fibra

 

O termo laser de fibra se refere à construção do meio de emissão do laser ou uma fibra para modificação da luz de laser. Para o Leica TCS SP8 X e o Leica TCS SP8 STED com STED fechado STED, são empregados os lasers conhecidos como supercontínuos (lasers de luz branca). O termo supercontínuo se refere à presença de efeitos não lineares na fibra fotônica que converte a onda de luz individual de uma fonte de bombeamento em um espectro amplo. O laser supercontínuo implementado produz um espectro branco que é livremente ajustado de 470 a 670 nm.

As fontes de laser convencionais fornecem apenas um pequeno número de linhas de comprimentos de onda individuais. Em consequência, lacunas grandes no espectro de excitação limitam a flexibilidade para excitar corantes não convencionais e novas proteínas fluorescentes. Por outro lado, as fontes de luz, como as lâmpadas de halogênio ou de metal halogenado produzem um espectro amplo, mas não são adequadas para microscopia confocal devido a restrições sobre o brilho e a falta de coerência.

O laser de luz branca efetivamente oferece as características de flexibilidade e de banda larga de uma fonte de luz que é combinado com o brilho e a coerência de um laser. A implementação da Leica combina essa fonte ajustável com o divisor de feixe AOBS, igualmente ajustável, e a detecção multiespectral. Isso coloca todos os aspectos do processo de fluorescência, ou seja, o comprimento de onda de excitação, a seleção de linhas, a combinação de cor e a banda de detecção sob total controle do usuário. O ajuste em tempo real com até oito linhas simultâneas oferece literalmente trilhões de combinações para configuração da excitação a laser. Como é uma fonte pulsada, o laser de luz branca também pode ser usado como uma fonte flexível para a aquisição de imagens por tempo de vida de fluorescência, especialmente para cobrir a difícil parte do espectro, verde e amarelo a laranja.

A Leica vai um passo além dessas aplicações óbvias e faz uso das propriedades dos WLL para diversas novas aplicações. Devido à capacidade de sintonização no intervalo µs, o sistema pode gravar espectros de emissão de excitação bidimensionais, o que envolve uma dimensão adicional para separação de fluoróforos e caracterização dos componentes de fluorescência da amostra. Além disso, em combinação com os HyDs como detectores de contagem de fótons, a luz de fluorescência pode ser separada em diferentes componentes por meio de um mecanismo de propagação de tempo (LightGate). Dessa forma, cada canal pode fornecer mais informações sobre os componentes derivados da reflexão, dos corantes fluorescentes e da autofluorescência – dependendo do respectivo tempo de vida de fluorescência. A supressão sem filtro da reflexão e o desenredamento de misturas complexas de espécies de fluorescência são possíveis. Em combinação com os sistemas STED, essa tecnologia de propagação aumenta a superresolução para menor de 50 nm. Leituras adicionais sobre o WLL:

  • Para obter detalhes sobre a geração supercontínua, sintonização do comprimento de onda, varreduras de emissão de excitação e Lightgate, consulte o artigo no Laboratório de Ciências da Leica por Rolf Borlinghaus e Lioba Kuschel.
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