Lentes de objetivas para aquisição de imagens confocal

A aquisição de imagens confocais tem as mais elevadas exigências sobre as lentes da objetiva. Para usufruir plenamente os benefícios da resolução da aquisição de imagens confocais, é necessário que o ponto focal criado pela objetiva tenha difração limitada para a faixa de comprimento de onda total de aplicação e o campo de visão. Parâmetros importantes da objetiva para imagens confocais são a abertura numérica (NA), a correção cromática e o nivelamento de campo.


Abertura numérica

A abertura numérica (NA) determina o poder de resolução e o brilho da imagem. É uma medida da largura e da profundidade do ponto focal produzido pela objetiva. É definida pelo seno da metade do ângulo de abertura a da lente e o índice de refração n do meio de imersão (Figura 1). De acordo com essa definição, quanto maior a abertura numérica, mais estreito será o ponto focal e, consequentemente, maior o poder de resolução.

Uma vez que a abertura numérica aumenta linearmente com o índice de refração n, para uma abertura numérica maior que 1 é necessário um meio de imersão com um índice de refração maior que 1, ou seja, diferente do ar. Uma abertura numérica maior normalmente exige um projeto mais completo envolvendo um grande número de elementos de lente e tolerâncias mais apertadas. A Figura 2 mostra uma comparação do foco produzido pelas objetivas de 40x com abertura numérica diferente, por meio de suas funções de dispersão pontual (PSF).

Figura 1 Definição de abertura numérica (NA). A abertura numérica é uma medida da largura do ponto focal. Ela depende do seno da metade do ângulo de abertura alfa e do índice de refração n do meio de imersão. Abertura numérica = n • seno alfa (com n=1 para o ar).

Figura 2 Comparação dos tamanhos dos pontos focais em função da abertura numérica. O traçado calculado das funções de dispersão pontual normalizou as intensidades contra duas coordenadas espaciais. Aberturas numéricas maiores resultam em um poder de resolução melhor, indicado por um tamanho de ponto menor.

Correção cromática

Uma lente ideal concentraria uma fonte de luz pontual em uma PSF real, cujas dimensões são determinadas pela abertura numérica da objetiva e o comprimento de onda da luz. No entanto, a forma e a posição de uma PSF real desvia-se de uma PSF ideal devido às imperfeições de uma lente real. Os resultados de tais imperfeições são chamados de aberrações. As aberrações que causam uma forma não ideal da PSF têm um impacto negativo na resolução e no contraste (aberração esférica, coma, astigmatismo). Uma posição deslocada da PSF resulta em uma geometria da imagem menos ideal (curvatura, distorção) ou o brilho da imagem e a sobreposição cromática (aberração cromática nas direções lateral e axial).

Na aquisição confocal de imagens, há elevadas exigências sobre o corte z e a aquisição de imagens multiespectral, sendo por isso que as aberrações cromáticas e a curvatura merecem atenção especial. As aberrações cromáticas são reduzidas por desenhos de lente especiais para certificar-se de que os diferentes comprimentos de onda sejam focados no mesmo ponto nas dimensões xy e z. Qualquer desvio do ideal reduz a qualidade dos ensaios de colocalização na caracterização funcional, porque seria possível chegar a falsas conclusões a partir do coeficiente de correlação correspondente. Além disso, com uma melhor correção cromática, a luz é recolhida de forma mais eficiente por causa de uma maior sobreposição entre a PSF de excitação e de emissão (veja a Figura 3).

Figura 3 Ilustração de como o sinal confocal depende das aberrações cromáticas (computadas.) As premissas são uma lente ideal de 63x / com abertura numérica de 1,40 com raio Airy ~ 190 nm, orifício infinitamente pequeno e excitação a 405 nm

Objetivas classe A para varredura confocal: HC PL APO CS2*

Melhores correções de aberrações cromáticas, esféricas ou outras aberrações acompanham a introdução de mais elementos de lentes e exigem maior precisão durante a fabricação. O projeto, portanto, torna-se mais complicado e a produção mais cara.

As objetivas são classificadas em três categorias em ordem crescente de qualidade: Acromáticas, semiapocromáticas e apocromáticas. As apocromáticas têm correção de cor para a faixa espectral mais ampla. Na categoria de apocromáticas, a Leica oferece lentes especialmente concebidas para atender às mais elevadas especificações de varredura confocal (CS). A série CS2 mais recente melhorou ainda mais em relação à série CS anterior e a correção de cor lateral recentemente desenvolvida anda de mãos dadas com a inovadora óptica UV da Leica TCS SP8. A excelente correção de cor das objetivas CS2 oferece uma melhor sobreposição de cor, especialmente na periferia da imagem.

*Abreviaturas:

PL plano, correção de nivelamento de campo

APO apocromática, correção de cores para as faixas de comprimento de onda vermelha, azul e verde

Uma visão mais geral das classes de objetivas oferecidas pela Leica Microsystems pode ser encontrada aqui.

Dedicado para excitação com 355 nm: HC PL APO UVIS CS2

Com a HC PL APO 63x/1,20 W CORR UVIS CS2 oferecemos uma objetiva com banda ultralarga dedicada para excitação com 355 nm. Ela oferece excelente correção de cor a partir de 345 a 730 nm. Isso a torna ideal para ensaios fisiológicos e de fotoativação usando a aquisição de imagens de linha única Ca2+ e relação de imagem, monitorando a expressão do gene ou a autofluorescência.

Objetivas para aquisição de imagens multifotônicas e CARS: HC PL IRAPO

Figura 4 Seleção de objetivas IRAPO apocromáticas infravermelhas corrigidas para a faixa próxima ao infravermelho do espectro do comprimento de onda. Portanto, são ideais para a aquisição de imagens MP, incluindo a excitação com OPO, bem como para CARS.

Na extremidade oposta do espectro de cores, um novo conjunto de objetivas especializadas agora está disponível para melhor aquisição de imagens multifotônicas (MP). As novas apocromáticas IR (Figura 4) têm correção de cor de até 1.300 nm e são altamente transmissíveis nas faixas de comprimento de onda visível e infravermelho com transmissão > 85 % a partir de 470 a 1.200 nm, tornando-as ideais para a aquisição de imagens não lineares como imagens multifotônicas de múltiplas cores, incluindo a excitação com OPO (oscilador paramétrico óptico) e CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering). Ver também a Figura 5.

Figura 5 Visão geral das diferentes correções de cor oferecidas para microscopia confocal pelos diferentes tipos de objetivas, CS2, UVIS CS2 e IR APO, respectivamente. As respectivas correções de cores de IRAPO, PL APO CS2 e PL APO UVIS CS2 foram projetadas para apoiar aplicações específicas de forma otimizada, certificando-se de que a colocalização e a eficiência de detecção sejam elevadas em todo o campo de varredura. O gráfico mostra como as faixas ideais (caixas com linhas sólidas) e as faixas utilizáveis (caixas com linhas tracejadas) se sobrepõem para proporcionar total cobertura da faixa de comprimento de onda de 355 a 1300 nm. Para a área verde tracejada entre 405 e 450 nm, a correção de cor está disponível com algumas objetivas CS2. Em combinação com a óptica de varredura ideal, ganha-se muita flexibilidade aplicativa por se ter a objetiva certa para cada experimento.