Orifício quadrado

A microscopia confocal permite a gravação de seções ópticas. Isso se torna possível por uma abertura variável localizada no plano focal conjugado (plano confocal) no eixo óptico: o orifício de detecção confocal. Ele bloqueia a luz fora de foco impedindo-a de chegar ao detector, levando a uma melhoria da resolução ao longo do eixo óptico (direção Z) por um fator de aproximadamente 1,4 quando comparado com um microscópio de campo amplo (para obter mais informações sobre o canal óptico de um microscópio confocal, consulte o Laboratório de Ciências da Leica). No plano confocal, cada ponto na amostra aparece como um modelo de difração típico, também conhecido como modelo Airy (Figura 1), sendo o máximo de difração central referido como o disco de Airy. A luz fora de foco é representada como os extremos máximos de ordem superior do modelo. Tipicamente, o orifício é ajustado de modo a permitir o máximo principal, a luz em foco, para gravação pelo detector. Esse ajuste é chamado de 1 unidade de Airy.


Como a adição do orifício, por outro lado, leva à perda de luz, é desejável que se tenha um orifício com tamanho ajustável para equilibrar o ganho de resolução e a perda de luz (para obter mais detalhes sobre a resolução e unidades Airy, consulte o Laboratório de Ciências da Leica). Um diâmetro do orifício ajustável é tecnicamente difícil de conseguir em uma geometria perfeitamente circular, razão pela qual são preferidas outras geometrias. A forma mais comum é a geometria de orifício hexagonal, semelhantes às aberturas nas objetivas usadas em fotografia. No plano confocal, a luz ainda não foi detectada, mas deverá passar para o sistema de detecção, onde é dividida ao longo da dimensão espectral para a aquisição de imagens multiespectrais. Depois da dispersão da luz, por um prisma nos confocais Leica, cada cor dá origem a um padrão de difração exclusivo (Figura 2). Quanto melhor a separação dos seus limites extremos principais, melhor será o poder de resolução espectral do microscópio confocal. A geometria do orifício tem um forte impacto no padrão de difração (Figura 3, fileira superior). Acontece que um arranjo de orifício quadrado é mais benéfico para cancelar os limites extremos secundários problemáticos e, portanto, resulta em melhor resolução espectral (Figura 3, fileira). Em microscopia de fluorescência, cada estrutura (biológica) de interesse é marcada com uma cor única e sua colocalização transmite informações importantes sobre a função biológica. A especificidade espectral por meio de um orifício quadrado, portanto, pode resultar em melhor caracterização funcional da amostra multicor.

Figura 1: O orifício confocal induz um padrão de difração no plano confocal. Uma unidade de Airy é definida como o seu máximo (ordem zero) principal e é o equivalente físico da luz em foco. Ao mudar o tamanho do orifício, é possível equilibrar a resolução óptica e a intensidade da luz. O tamanho físico do orifício depende da geometria exata do trajeto do feixe e da ampliação da óptica. Portanto, as unidades de Airy são mais úteis para se comparar os tamanhos dos orifícios do que o seu diâmetro físico.


Figura 2: Modelos de difração para duas cores depois de passar através de um prisma. Na aquisição de imagens multiespectral, a especificidade é influenciada pela capacidade de resolver dois modelos de difração adjacentes.

Figura 3: Padrões de difração causados por diferentes geometrias do orifício (ilustração esquemática baseada nos modelos de difração computados). Fileira superior: Orifício circular (A), hexagonal (B) e quadrado (C). Fileira inferior: Separação de dois modelos adjacentes, como a causada por cores diferentes para geometrias circular (D), hexagonal (E) e quadrada (F). A separação de cor é importante para a aquisição de imagens multiespectral. Graças à sua falta de intensidade entre dois limites extremos de difração de primeira ordem, a geometria quadrada do orifício possibilita a supressão mais fácil de ordens superiores. O ganho na separação espectral é de aproximadamente 1,5 (patente nos EUA 6.801.359 B1).