Campo de visão do scanner

Imagem com um único disparo

 

Enquanto os microscópios foram inventados para investigar pequenos detalhes, eles geralmente precisam ser colocados no contexto. Para isso, é necessário ver uma região maior do seu ambiente. O tamanho da área visível da imagem de um microscópio é determinado pelo campo de visão (FOV) do instrumento. O FOV em um instrumento confocal é influenciado pelo layout óptico que consiste em objetiva, óptica de varredura e scanner. Para permitir um amplo FOV, o desafio técnico é iluminar homogeneamente a área sem a perda de resolução do centro para as bordas.

Iluminação homogênea em um microscópio confocal de varredura a laser

 

Na versão mais simples de um microscópio de varredura a laser, temos uma lente objetiva OL e um espelho de varredura MSc (Figura 1). Nesse arranjo, se o espelho de varredura for ligeiramente inclinado, o que é necessário para o processo de varredura, a pupila da lente objetiva (mostrada como a abertura laranja) não é mais completamente preenchida. Portanto, as bordas da imagem não são iluminadas adequadamente. Isso leva a uma perda de intensidade e resolução.


Figura 1 Além da objetiva, os sistemas confocais normalmente utilizam uma lente de tubo TL posicionada a uma distância fTL em relação ao plano focal de fundo da objetiva e uma lente de varredura ScL posicionada na distância fScL em relação ao plano focal de fundo da lente do canal para obter iluminação com difração limitada (Figura 2). Se o espelho de varredura for, então, posicionado na distânciafScL em relação à lente de varredura, falamos de um "arranjo 4 f" uma vez que estamos cobrindo quatro comprimentos focais f entre a objetiva e o espelho de varredura. Em seguida, a pupila é preenchida completamente em todas as posições do espelho de varredura, resultando na iluminação homogênea de todo o campo.

Figura 2: Como evitar vinhetas ou perda de resolução periférica usando um arranjo de scanner 4f. A lente de varredura (ScL) e a lente de tubo (TL) são posicionadas de forma a conjugar o espelho de varredura (MSc) com a pupila posterior (OL) da lente objetiva.

Em um sistema confocal com dois espelhos de varredura, um para a dimensão x e outro para y, uma solução de compromisso deve ser feita ao posicionar os espelhos de varredura. Um dos espelhos ou ambos são colocados fora do plano conjugado. Isso limita o campo utilizável, pois ocorre uma perda de intensidade e resolução em direção às bordas do campo.

Ao contrário de todos os outros scanners confocais, o scanner Leica X2Y incorporado no Leica TCS SP8 utiliza três espelhos de varredura, um para a dimensão x e dois para a y. O segundo espelho Y do scanner X2Y garante que o ponto de articulação do feixe de luz na pupila posterior da OL esteja sempre centralizado. Por meio dessa disposição, pode-se manter o arranjo ideal 4f para evitar vinhetas e perda de resolução (Figura 3).

Figure 3 X2Y scanner design to maximize field of view by introducing a second Y-galvanometer mirror. The X2Y-system ensures the pivot-plane of the scanning beam is not moving laterally. This avoids image degradation off-center that occurs, when the mirror is not placed in a plane conjugated to the back focal plane.

Os scanners XY são limitados no tamanho do campo, mas com o sistema de varredura X2Y da Leica, o número do campo aumenta para até 22. Na ampliação de 10x, isso equivale a um quadrado de 1,5 x 1,5 mm2. Um campo de visão maior permite que uma amostra maior caiba inteiramente em uma única imagem individual ou permite adicionar mais contexto a uma topologia complexa, como uma amostra de tecido (Figura 4).

Figura 4: Platynereis dumerilii, 2 meses. Azul: núcleo, DAPI. Verde: tubulina, FITC. Cinza: faloidina, rodamina. Vermelho: serotonina, Cy5. Todo o organismo cabe em uma única imagem (FOV). Projeção máxima em 3D de imagem tirada com uma objetiva 10x totalmente ampliada no formato de varredura de 5.000 x 5.000. Amostra: cortesia de Dr. Antje Fischer e Dr. Detlef Arendt, Heidelberg, Alemanha