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共聚焦显微术基础

共聚焦显微镜基本原理

在共聚焦显微镜中,所有焦平面以外的信号都不会参与成像。

这是由光路中一对光学共轭的针孔实现的,其作用是分别协助形成点光源和点探测。

检测针孔阻挡焦平面以外的光

焦平面的厚度除了取决于激发光波长,还主要取决于所用物镜的数值孔径和检测针孔的直径。

增大针孔将减弱共聚焦效果

为获取完整图像,激光光点由扫描镜带动,在样品上移动扫描。

发射/反射光通过检测针孔后,由光电倍增管转换为电信号显示在电脑屏幕上。

共聚焦显微镜的优势

与常规显微镜相比,共聚焦显微镜主要优势如下:

  • 不记录焦平面以外的光信号
  • 离焦不会产生模糊,但会由于目标离开焦平面而损失部分信号,这部分信号将逐渐变暗直至消失。这一特性称为光学切片。
  • 可记录真正的三维数据
  • 在x/y方向以及z方向(沿光轴)扫描样品,可对样品进行全方位观察
  • 激发光点在焦平面上所占区域非常小,可将散射光减至最少
  • 通过图像处理,可将不同层面的切片叠加,获得景深扩展图像。在常规显微镜上可通过减小光阑实现这一功能,但会损失分辨率。