冷冻扫描电镜工作流中高压冷冻和冰冻断裂的专家访谈

Roland A. Fleck简介

ROLAND A. FLECK,哲学博士、英国皇家病理科医学院荣誉院士(FRCPath)、皇家显微镜学会会员、超结构成像教授、伦敦国王大学超结构成像中心主任。专业方向为低温下和冷冻保存过程中细胞损伤的基本研究,掌握组织冰冻断裂/冰冻蚀刻制备专业知识和更广泛的冷冻显微镜技术。作为超结构成像中心主任,支持通过传统室温和冷冻电子显微技术进行细胞和组织的高端三维研究。哥本哈根大学健康和医学科学院访问教授,教科文组织低温生物学教席教授,乌克兰哈尔科夫国家科学院低温生物学问题研究所兼职教授。

您的部门负责哪些工作?您的实验室主要采取何种工作流?徕卡工作流组合如何支持这些工作?

我们为国王大学的所有研究活动提供支持,主要是生命科学,不过我们也支持材料和化学方面的基础研究。我们使用的工作流,室温电镜和冷冻电镜各占一半。室温研究支持针穿活检诊断电镜,这项工作非常简单且常用。我们用EM TP进行室温样品制备,接着用EM UC7显微切片机切片,然后用透射电镜成像。还有许多更高级的细胞和组织切片室温制备方法,可在成像前保持方向。还可以使用树脂制备样品,用于连续端面(Serial Block-face)扫描显微镜检查等工艺,这也比较常用。此外,我们也使用徕卡振动切片机制备组织样品。

提到高通量冷冻技术,我们广泛采用Tokuyasu技术,轻微固定后在配备冷冻箱的超薄切片机中切片,切片机温度为-80°C,接着进行免疫金标记,最后以透射电镜成像。稍微更高级点的采用高压冷冻、冷冻置换、免疫金标记和X线断层摄影工作流。我们还有其他纯粹冷冻的工作。比如,结构生物学单粒子项目,使用冷冻仪EM GP、Blot和冷冻透射电镜成像,还采用CEMOVIS技术制备冷冻组织切片。因此,先是高压冷冻和冷冻切片,接着是冷冻透射电镜工作流,之后是冷冻扫描电镜工作流。基本上,我们使用高压冷冻EM ICE、冰冻断裂系统EM ACE900、带EM VCM装载站的EM VCT500传输系统以及用于配备VCT冷冻载物台的冷冻扫描电镜的JEOL 7800 Prime。

冷冻扫描电镜研究的优点是什么?

速度更快。有一天,我把样品带到实验室,使用高分辨率扫描电镜拍摄图像,不到两个小时就完成了,而且中途我们还顺便吃了午饭。非常方便。现代扫描电镜处理速度很快,性能也不错,可与透射电镜媲美。由于扫描电镜信号采集本身的性质,还可以获得形态方面的信息。

你们一般利用冷冻扫描电镜工作流研究哪种样品?

细胞和组织。特别是细胞,非常有意思。冷冻扫描电镜适合任何需要在高放大倍率条件下观察的细胞器和结构众多的复杂样品。比如,果蝇胚胎就很不错,因为它的结构比较复杂;还有红细胞里的疟原虫,因为它的结构复杂、有趣,而且比较大,不适合制作透射电镜切片。扫描电镜视野更广,放大倍率高,这也是它的优点。

你们在哪方面研究使用高压冷冻柜?

高压冷冻柜相当有用,是工作流不可或缺的一部分。神经学家进行电刺激时会用到它,电刺激之前的光刺激也用到它。其他光响应样品需要重复光刺激。我们还在联锁输送器和管系统中制备3mm和6mm规格的样品,所以说高压冷冻柜是一种非常通用的工具。

您选择EM ICE的标准是什么?

服务和支持。它是基于HPM100改进的,我认为它的品质很好。它的制冷原理非常适合样品的冷却,比湍流输送冷却剂更有效。我对EM PACT的配置不太感冒,冷却和压力分开,我觉得不好。而EM ICE的基本设计和HPM010一样,只不过是做了一些改进。我认为它的理论和技术设计都不错,服务和支持也可靠。

EM ICE的可用性如何?

教会别人使用它很容易。如果你熟练掌握一些手动程度更大的仪器,你将很快学会使用它。它与HPM100不同之处在于,在HPM100上我可以时时刻刻更快地将样品转移到LN,而在EM ICE上一般操作人员可以时时刻刻同样快速地转移样品,这就是后者的有用之处,很容易上手。

您为何选择在实验室中配置EM ACE900?

因为我过去几年一直在使用冰冻断裂系统,知道它们是一种多用途设备。它们是非常强大的高真空冷冻处理工具,我的大部分工作流都以它们为中心。镀膜质量相当好,真空室始终处于高真空状态,非常干净,传输到扫描电镜的真空传输功能很出色。不必拥有丰富的经验即可获得不错的结果。这就是我选择这种系统的原因所在,功能非常强大。

您认为使用冷冻扫描电镜和经典复膜透射电镜工作流进行冰冻断裂研究的前景如何?

在我看来,冷冻扫描电镜在冰冻断裂研究的应用应更多,因为现代场发射电子枪(FEG)扫描电镜的性能很好且易于达到,如果配备可靠的高压冷冻、冰冻断裂系统和冷冻传输系统,将可以使用该系统进行日常的高分辨率工作,不过必须首先了解工作流。但是,现在的工作流已经相当普及了,普通用户也可以使用,无需成为专家就可以实施全部操作。说到经典的冰冻断裂,我个人认为,如果它与免疫表及技术及更先进的电镜技术结合,将可以发挥作用,但开发难度相当大,正确应用也不容易。

徕卡工作流用于研究项目有何优点?

主要一点,理论上不同可用仪器之间可以兼容。理想的情况是,圆片应与我们想开展的冰冻断裂作业类型相匹配,而后者与扫描电镜可用的载物台相匹配。同样的道理适用于不同组织的冷冻置换,我们应当确保,每一种耗材都与设备匹配,很快传输到工作流中的下一台设备。在许多情况下,徕卡显微系统可以做到这一点。

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