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Erster integrierter Kryoelektronentomographie-Workflow

Zellmechanismen mit Subnanometer-Auflösung in 3D darstellen

Für die ausführliche Untersuchung komplexer biologischer Mechanismen benötigen Biowissenschaftler zuverlässige strukturelle Informationen über die Zielmoleküle in ihrem subzellulären Kontext. Dazu müssen die Zielmoleküle und ihre zelluläre Umgebung im Subnanometerbereich präzise aufgelöst werden. 

Leica Microsystems und Thermo Fisher Scientific haben gemeinsam einen perfekt abgestimmtem Kryoelektronentomographie-Workflow entwickelt, der diese wissenschaftlichen Anforderungen erfüllt. Sicherer Proben- und Datentransfer  zwischen den Systemen gewährleistet einfache Navigation zu den zellulären Zielregionen und zuverlässige Ergebnisse in Subnanometer-Auflösung.

Daten mit freundlicher Genehmigung der Abteilung für Molekulare Strukturbiologie, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried

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Kryo CLEM Produkte 6

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Leica EM Cryo CLEM-Set basierend auf Leica DM6 FS

EM Cryo CLEM

Korrelatives Licht- und Elektronenmikroskopie-System

Hochdruckgefrieranlage Leica EM ICE

Leica EM ICE

Hochdruckgefrieranlage mit optionaler Licht- und/oder Elektrostimulation

Leica EM FC7, Kryokammer für die Ultramikrotome Leica EM UC7, EM UC6

Leica EM FC7

Kryokammer für die Ultramikrotome Leica EM UC7, EM UC6

Leica DM6 FS Fixed-Stage-Fluoreszenzmikroskop

Leica DM6 FS

Fixed-Stage Mikroskop für die Elektrophysiologie und In-Vivo-Imaging

Kryoelektronentomographie-Workflow

Schritt 1: Vitrifizierung

Die untersuchten Zellen werden auf einem Netzplättchen für die Elektronenmikroskopie kultiviert.

Vor dem Gefrieren wird die Probe in einer Klimakammer mit kontrollierter Feuchtigkeit bei stabiler Temperatur aufbewahrt.

Dann wird die Probe mit dem automatischen Plunge Freezing System EM GP2 vitrifiziert.

Durch den Vitrifizierungsprozess wird die Bildung von Eiskristallen verhindert, sodass der Zellinhalt so nahe wie möglich am nativen Zustand bleibt.

Schritt 2: Auswahl

Für einen effizienten Workflow müssen geeignete Zellen und Zielregionen ausgewählt werden. Dafür wird das Kryo-Lichtmikroskop Leica EM Cryo CLEM eingesetzt. Anschließend kann die Probe für den Fräsprozess zum Thermo Scientific™ Aquilos™ transferiert werden. Vollständige Konnektivität zwischen den Systemen bedeutet, dass die definierten Regionen und ihre Koordinaten sicher und präzise zum Aquilos übertragen werden. Kein Zeitverlust durch die Suche nach den relevanten Zielpositionen!

Zur Vermeidung einer Verunreinigung kostbarer Proben gewährleistet der Integrierte Kryotomographie-Workflow einen sicheren Transfer der Proben zwischen den beteiligten Systemen. Das spezielle Kartuschensystem schützt Ihre Probe während des gesamten Workflows und liefert somit die solide Grundlage, um zuverlässig Tomographiedaten zu erhalten.

(Thermo Scientific, Krios und Aquilos sind Marken von Thermo Fisher Scientific.)

Schritt 3: Fräsen

Nach Vorauswahl und Markierung der Zielregionen im EM Cryo CLEM wird die Probe zum Thermo Scientific Aquilos, einem dedizierten Kryo-DualBeam-Elektronenmikroskop, transferiert.

Früher war es nicht möglich, das Zellinnere mit Subnanometer-Auflösung darzustellen, da viele Proben einfach zu dick für die Bildgebung mit der Kryo-Elektronen tomographie waren. 

Das Aquilos überwindet die Dickenbegrenzungen durch Einsatz eines Rasterelektronenstrahls (Scanning Electron Beam - SEM) und eines fokussierten Ionenstrahls (Focused Ion Beam - FIB). Während der Elektronenstrahl für die Bildgebung verwendet wird, gewährleistet ein Galliumionenstrahl das präzise Fräsen der vitrifizierten Zellen. 

Durch den Ätzvorgang entsteht eine dünne Eisschicht, die Lamelle, die anschließend elektronentomographisch untersucht werden kann. 

Schritt 4: 3D-Kryo-Tomographie

Das EM-Netzplättchen, das die Zellen, einschließlich der Lamelle, trägt, wird vom Aquilos zum Thermo Scientific Krios™ G3i (Cryo TEM) transferiert.

Im Cryo TEM wird die Probe schrittweise geneigt und so die relevante Region mehrfach aus unterschiedlichen Winkeln dargestellt.

Die Einzelbilder werden digital ausgerichtet und rekonstruiert, sodass aus der Lamelle und ihrem Inhalt ein dreidimensionales Tomogramm in Subnanometer-Auflösung entsteht.