Der Kontrast ist klar

Lebenszeit-Messung im Nu SP8 FALCON

Das Leica SP8 FALCON (FAst Lifetime CONtrast) stellt die Zukunft der funktionalen Bildgebung dar. Nutzen Sie die Möglichkeiten der Fluoreszenzlebenszeit-Bildgebung, um die Physiologie und die Dynamik lebender Zellen zu untersuchen.

Das SP8 FALCON ist die erste echte integrierte Lösung für LebenszeitBildgebung (Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM) und liefert hochwertige Ergebnisse mindestens zehnmal schneller als herkömmliche Systeme.

Das SP8 FALCON erweitert den Bildkontrast um eine neue Dimension und eröffnet den Weg zu Biodetektion und zur Verfolgung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen. FLIM-Informationen stehen damit bei allen Modalitäten der SP8-Plattform zur Verfügung.

Sie können jetzt:

Schnelle molekulare Wechselwirkungen mit FLIM-FRET (Förster Resonance Energy Transfer) verfolgen
Mit Biosensoren Änderungen im metabolischen Zustand und in der Mikroumgebung erkennen
Fluorophore durch Lebenszeitkontrast voneinander trennen
Lebenszeit-Daten mit einem Mininum an Einarbeitungszeit gewinnen

Histologischer Schnitt aus einem Katzenauge. Die gleichzeitige spektrale (grau) und FLIM-Konfokalbildgebung (farbig) macht den Lebenszeitkontrast deutlich. Aufnahme und Visualisierung mithilfe des SP8 FALCON und der Software LAS X.

Verfolgen von molekularen Wechselwirkungen mit FLIM-FRET

Die moderne Forschung untersucht, wie Moleküle zusammenwirken, um wesentliche Aufgaben zu erfüllen. Erfolgreiche biomedizinische Studien setzen FLIM-FRET zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen ein.

Das SP8 FALCON setzt einen neuen Geschwindigkeitsmaßstab für FLIM-Geräte. Es ermöglicht FRET-Messungen bei hochdynamischen Zellprozessen. Damit können Sie in Ihren üblichen Experimenten FRET-Daten erfassen und interpretieren.

Caged cAMP in HeLa cells expressing EPAC mT2-dVenus FRET sensor. EPAC response to UV-mediated cAMP uncaging (central area). Movie recorded at 4 fps. Image size: 256 x256 pixels. Color bar scale (lifetime): ns. Courtesy Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

Kalzium-Oszillationen nach Stimulation mit Thrombin aktivierendem Peptid. Die Reaktion in einzelnen Zellen wird als Veränderung der Lebensdauer aufgezeichnet. Filmaufnahme mit 4 Bildern/s. Bildgröße: 256 x 256 Pixel.

Beobachten von kleinsten, schnellen Veränderungen mit Biosensoren

Stoffwechselaktivitäten, Signalmechanismen, Änderungen des pH-Werts und der Mikroumgebung können sehr gut mit Biosensoren beobachtet werden.

SP8 FALCON ermöglicht den Zugang zu diesen auf der Fluoreszenzlebensdauer basierenden Informationen - selbst bei sehr schnellen Ereignissen, wie der Membranpotentialdynamik. Diese Informationen ergänzen die bereits sehr leistungsstarke Spektralbildgebung der SP8-Plattform.

Zuverlässigere und sensitivere Metabolismus-Bildgebung

Bei der herkömmlichen Bildgebung ist Autofluoreszenz störend. Das SP8 FALCON kann daraus jedoch wertvolle Informationen gewinnen. Jetzt können Sie die Autofluoreszenz nutzen, um etwas über den metabolischen Zustand, die Zelldifferenzierung und die Krebsentwicklung zu erfahren. Außerdem ermöglicht das SP8 FALCON einen Kontrast in lebendem Gewebe abzubilden, in dem Fluoreszenzfärbung normalerweise unspezifisch ist oder die physiologischen Bedingungen zerstört.

Autofluoreszenz in Säugerzellen unter nicht-physiologischen Bedingungen (pH 8,5). Das Signal korreliert mit den Änderungen im endogenen NAD/NADH-Pool. Die Entwicklung des oxidativen Stresses wird als Verringerung der Lebenszeit über einen Zeitraum gemessen. Originalbildgröße: 512 x 512 Pixel. Farbzuordnungstabelle (Lebenszeit): ns. Zwei-Photonen-Bilderfassung mit dem SP8 DIVE in Kombination mit dem SP8 FALCON.

Intensity

FLIM

Trennung von Fluorophoren über die spektralen Möglichkeiten hinaus

Fluoreszenzfärbung ist ein Standardverfahren zur Unterscheidung intrazellulärer Strukturen. Spektraler Trennung ist äußerst effizient, aber wenn die Emissionsspektren zu eng beieinander liegen, stößt diese Methode an ihre Grenzen.

Mit dem SP8 FALCON können Sie diese Einschränkungen durch die zusätzliche Dimension der Fluoreszenzlebenszeit aufheben. Es eröffnet Ihnen die Möglichkeit viele Fluoreszenzspeziesvoneinander zu trennen.

Durch die Palette integrierter Optionen, die die SP8-Plattform bietet, haben Sie sogar noch weitere Freiheiten. Dazu gehören unter anderem die Weißlichtlaser-Anregungsquelle, akusto-optische Strahlteiler und die Mehrkanal-Spektraldetektion.

Bild: Zellskelettstrukturen unterschieden nach Lebenszeitkontrast. Vimentin immunmarkiert mit Alexa Fluor 555 (grün) und Tubulin immunmarkiert mit Alexa Fluor 546 (blau). Die Fluorophore sind sich spektral sehr ähnlich, können aber anhand der Fluoreszenzlebenszeit getrennt werden. Bildgröße: 512 x 512 Pixel.

SP8 FALCON Bildgebung steht für FAst Lifetime CONtrast

Das SP8 FALCON Mikroskop überwindet die bisherige Geschwindigkeitsbegrenzung bei FLIM und ermöglicht nun einen schnellen Zugang zu Lebensdauerdaten.

Aufgrund technischer Limitierungen war es bisher schwierig, die Fluoreszenzlebensdauerdaten aus schnellen Prozessen zu extrahieren um funktionale Informationen zu erhalten. Die FLIM-Aufnahmegeschwindigkeit war mindestens zehnmal langsamer als die Aufnahme der Konfokalintensität.

Durch die schnelle Kontrastabbildung der Lebensdauer mit dem SP8 FALCON können dynamische Prozesse in Zellen mit der angemessenen Geschwindigkeit verfolgt werden. Diese Vorgänge werden durch eine neue Weise der Zeitmessung mit TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) in Kombination mit intelligenten Algorithmen für die Datenverarbeitung und -analyse ermöglicht.

Einzelkanalbild fluoreszenter Kügelchen (magenta) in einer Lösung, die Alexa Fluor 555 (grün) enthält. Fluorophorentrennung anhand der Fluoreszenzlebensdauer ist in verschiedenen Geschwindigkeiten möglich, zum Beispiel mit 16 fps (oben), 27 fps (Videofrequenz, Mitte) und 83 fps (ultraschnell, unten). Die Farbstofftrennung anhand von Lebensdauerinformationen ist deutlich vorteilhafter als anhand der Intensität (Graustufen). Die Videos zeigen eine Pixel-für-Pixel-Approximation der Lebensdauerkomponenten. Bildgröße: 512 x 64 Pixel. Skalenleiste: 10 µm.

Einfache Erfassung komplexer Proben. Hochauflösendes Mosaikbild eines Mäuseembryos mit 722 Kacheln aus 190 Megapixeln. FLIM-Daten mit vier charakteristischen Fluoreszenzlebensdauern, farbig gekennzeichnet. Erfassung: 1.23 h. Analyse: 1.00 h

Alles in einem: Multimodale Bildgebung

Die Kombination von FLIM mit anderen Verfahren war noch nie so einfach wie mit dem SP8 FALCON. Bis jetzt mussten Forscher komplizierte Verkabelungen und eine mühsame Dateiübertragung in Kauf nehmen. Mit dem SP8 FALCON erhalten Sie die Lebenszeitinformation ganz einfach integriert zu Ihrer Standardmessung dazu.

Das SP8 FALCON ist vollständig in die Aufnahme- und Analysesoftware LAS X integriert. Es kann FLIM in vier Spektralkanälen gleichzeitig und bis zu zehn Kanälen nacheinander aufnehmen. Mit dem SP8 FALCON können Sie den Lebenszeitkontrast in 3-D-Stapeln, Zeitraffersequenzen und sogar in großen Mosaikkachelformaten messen.

Mit dem neuen LAS X NAVIGATOR können Sie den Sichtbereich bis zu 10.000-fach vergrößern, was wertvolle Zeit beim Identifizieren von interessanten Bereichen erspart und ganz neue Möglichkeiten zur Untersuchung Ihrer Proben bietet.

Einfache Lebenszeitmessungen mit Phasoren

Die Analyse mit dem SP8 FALCON unter Verwendung von FLIM-Phasoren bietet eine 2D-Darstellung von Lebenszeitkomponenten.

Mit FLIM-Phasoren können Sie Veränderungen der Mikroumgebung verfolgen, in dem Sie Komponenten auswählen, um Signale zu bündeln und die FRET-Effizienz zu bestimmen.

Der FLIM-Phasor ermöglicht es, die Auflösung von STED-Bildern zu verbessern. Es kann dieselbe Auflösung mit weniger STED-Leistung erreicht werden (Lanzanò u. a., Nature 2015).

Mit Alexa555-Phalloidin und H2B mCherry markierte Zellen. Trennung mit FLIM-Phasoren. Das Phasordiagramm zeigt deutlich zwei Verteilungen. Mit freudlicher Genehmigung von Dr. Martin Stöckl, Institut für Biologie, Universität Konstanz.

Die gewünschten Ergebnisse,– mit einen Klick

Die LAS X-Software ermöglicht FLIM mit wenigen Mausklicks und der gleichen Philosophie wie bei der routinemäßigen spektralen Bildgebung.

Selbst wenn Sie Mikroskopie nur als ergänzende Technik einsetzen, können Sie die wichtigen Elemente sofort erkennen und sofort mit der Bildgebung beginnen.

Besondere Funktionen stehen als vorgegebene Arbeitsabläufe zur Verfügung und ermöglichen so eine komfortable Automatisierung.

1-click philosophy to focus on your science: SP8 FALCON controlled by the LAS X software

Untersuchungen von Molekulardynamiken mit SP8 FCS

Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (Fluorescence Correlation Spectroscopy – FCS) ist eine quantitative Technik in der Mikroskopie. Sie wird genutzt, um Partikelkonzentration, Diffusionskoeffizienten, Viskosität, Molekularmasse, Bindungskonstante und photophysikalische Eigenschaften basierend auf Intensitätsschwankungen zu untersuchen.

Die Kombination von FCS und FLIM ermöglicht Versuche im Bereich der Fluoreszenz-Lebenszeit-Korrelations-Spektroskopie (Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy – FLCS). FLCS wird eingesetzt, um die Wechselwirkung von Molekülen zu untersuchen, die spektral nicht trennbar sind, und um Hintergrundbeiträge zu eliminieren.

STED verringert das Fokalvolumen. Deshalb liefert STED FCS molekulare Informationen auch in hohen Konzentrationsbereichen (> 100 nM), in denen konfokales FCS seine Grenzen erreicht.

Bild oben: Intensitätsverläufe und Autokorrelationskurven für unterschiedliche Atto488-Konzentrationen verringern die Amplitude durch Erhöhen der Konzentration. Bild unten: Anregungsvolumen bei konfokalem (links) und 3D-STED (rechts). Das geringere Volumen im Fall von STED ermöglicht die Messung von Fluktuationen bei höheren Molekülkonzentrationen.

Fachleute meinen:

"Wir haben das Leica SP8 FALCON eingehend geprüft. Es ist in jeder Hinsicht ebenso präzise wie dedizierte TCSPC-Lösungen, lässt sich aber intuitiv bedienen und bietet Turbogeschwindigkeit. Meiner Meinung nach stellt es eine Revolution für die funktionale Bildgebung dar." - Prof. Kees Jalink, Ph. D., Netherlands Cancer Institute, Amsterdam

"Die neue FLIM/FCS-Lösung von Leica wird ihre Anwendungsmöglichkeiten erweitern– sie ist unglaublich schnell, flexibel und einfach zu bedienen." - Prof Christian Eggeling, University of Oxford

"Die meisten FLIM-Geräte sind Zusatzmodule. Hier haben wir es mit einer ganz anderen Herangehensweise zu tun: einem echten integrierten System – sehr leistungsstark!" - Prof. Enrico Gratton, UCI Samueli, University of California, Irvine

"Das Leica SP8 FALCON ist das erste kommerzielle System mit integrierter Konfokal- und Lebenszeit-Bildgebung, das ich mir vorstellen kann in einer führenden Einrichtung einzusetzen." - Hochschulleiter Prof. Scott E. Fraser, Ph. D., University of Southern California, Los Angeles

Oben: Vielseitige Plattform SP8 (links), Nanoskopie (Mitte), Superauflösung (rechts)
Unten: CARS (links), Lichtblatt (Mitte), Multiphoton (rechts)

Teil der Produktfamilie TCS SP8

Das SP8 FALCON ist die neuste Ergänzung zur etablierten SP8-Plattform von Leica Microsystems. Diese Plattform kann an verschiedene Forschungsmethoden von der Konfokalmikroskopie mit Hochauflösung bis zur STED-Nanoskopie angepasst werden.

Für die Benutzer bietet dies sowohl Vielseitigkeit als auch Investitionsschutz.

Alle Geräte der SP8-Plattform lassen sich jetzt und in Zukunft an die Forschungsmethoden der Benutzer anpassen.