Kontaminationsfreies FRET mit Hilfe von FLIM λ-Stapeln

Mit Hilfe von FLIM wird FRET-Effizienz aus dem Unterschied der Donor-Lebenszeit in Anwesenheit und Abwesenheit eines Akzeptors errechnet. Für eine verlässliche Quantifizierung muss das Detektionsfenster zu dem Emissionsspektrum des Donors passen. Man muss jede andere Fluoreszenz wie Autofluoreszenz und Akzeptor-Fluoreszenz ausschließen.

Die Suche nach dem korrekten Detektionsbereich kann sehr zeitaufwendig sein, wenn Bandpass-Filter umgeschaltet werden müssen. Ein schnellerer und einfacherer Ansatz basiert auf die spektral aufgelöste Detektion. Der SMD FLIM-Wizard verfügt über einen xyλ-Modus mit dem der Benutzer die Aufnahme von Wellenländen-Scans automatisieren kann. Diese Option ist gibt es nur bei Systemen, die mit internen SP FLIM-Detektoren ausgestattet sind.

Beispiel rechts:

Der optimale optimale Detektionsbereich für unbeeinflusstes FRET wird identifiziert (siehe Schritte 1 bis 4, rechts).

GFP, GFP-mCherry tandem, GFP+mCherry wurden in HeLa-Zellen exprimiert. Es wurde eine FLIM-λ-Serie von allen drei Proben aufgenommen. Das Diagramm der durchschnittlichen Lebenszeit bei Detektionswellenlängen zeigt, dass der optimale FRET-Detektionsbereich bei 485 bis 545 nm liegt (Konstante Werte).

Mit freundlicher Genehmigung von Dr. M. Weiss, Dr. J. Szymanski, DKFZ, Heidelberg, Deutschland

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