Descubrimiento de la morfología celular más allá del límite de difracción

Autor
Dr. Jochen Sieber, Leica Microsystems

Los científicos se esfuerzan por comprender la arquitectura de la vida. Quieren comprender cómo se organizan las estructuras biológicas unas respecto a otras. ¿Se colocalizan en el interior o se excluyen de la misma superestructura? ¿Sigue la localización un patrón especial y cómo se refleja la organización general en la función biológica? La obtención de imágenes de súper-resolución multicolor permite abordar estas preguntas fundamentales mediante microscopía de fluorescencia de campo lejano con un nivel de detalles sin precedentes.

Exploración más allá del límite de difracción

A pesar de todos los importantes conocimientos obtenidos con la microscopía de fluorescencia convencional, es fácil acabar frustrado cuando se estudian estructuras subcelulares, ya que las entidades biológicas de interés a menudo son bastante más pequeñas que el límite de difracción. Con microscopios de fluorescencia de campo lejano convencionales, que son incapaces de distinguir los objetos que están más cerca entre sí que aproximadamente 200 nm, los detalles de interés quedan difuminados y se pierden. Varios métodos de microscopía de súper-resolución de campo lejano superan este obstáculo fundamental y permiten el estudio de detalles morfológicos mucho más allá del límite de difracción.

La obtención de imágenes de agotamiento de la emisión estimulada (STED)1, al igual que la microscopía de escaneado láser confocal, mueve un punto de luz de excitación por la muestra, detecta la fluorescencia emitida y genera píxel por píxel la imagen del corte óptico observado. Para lograr la súper-resolución, el punto de excitación limitado por difracción se superpone con una función de distribución de punto en forma de rosca de un segundo láser: el láser STED. Un proceso denominado emisión estimulada evita que los tintes emitan fluorescencia en cualquier punto del volumen focal excepto para el centro de la rosca. El valor por el que se puede reducir el enfoque efectivo, es decir, la resolución que se puede alcanzar, depende de la intensidad del láser STED así como del tinte. Con el Leica TCS STED, se logra de forma rutinaria una resolución lateral de menos de 60 nm con, por ejemplo, Atto 647N. La microscopía confocal y de STED son una combinación perfecta y se pueden implementar rápidamente en la misma configuración. Con productos actualmente en el mercado como el Leica TCS STED CW, el usuario puede alternar entre la resolución confocal y STED con un solo clic del ratón.

Cómo lograr la súper-resolución confocal 2C

La microscopía STED permite la obtención de información objetiva con rapidez sobre la estructura y la organización de una entidad biológica de interés. El siguiente paso consiste en dar contexto a esta información. Se puede aprender mucho explorando una estructura con una resolución de, por ejemplo, 60 nm y obteniendo imágenes de varias contratinciones confocales al mismo tiempo. Sin embargo, observar la organización de dos estructuras, una respecto de la otra, con un nivel de detalle limitado por subdifracción, abre la puerta a un mundo completamente nuevo de estudios de colocalización (Fig. 2).

Se han notificado dos perspectivas para obtener imágenes STED (2C) de dos colores. La primera es exigente desde un punto de vista técnico y utiliza dos conjuntos independientes de longitudes de onda STED y de excitación para dos tintes separados espectralmente2. La segunda solución (la "perspectiva de rosca") utiliza un fluoróforo estándar (desplazamiento de Stokes 10 – 30 nm) en combinación con un tinte de desplazamiento de Stokes grande (p. ej. >100 nm para Chromeo 494) de espectros de emisiones parcialmente solapados3. Esto permite el uso de un solo láser STED. Se aprovechan las diferencias en los espectros de excitación para distinguir los dos tintes. Para generar una imagen 2C, se registran dos fotogramas con distintas líneas de láser de excitación activas en cada fotograma. Con la combinación adecuada de tintes y una tinción equilibrada, esta perspectiva permite recopilar imágenes STED 2C nítidas, aunque se detecte la misma banda para ambos canales. Por supuesto, las diferencias en los espectros de emisiones también se pueden aprovechar para ayudar a distinguir los tintes. La ventaja de aplicar la misma rosca de STED a ambos canales de súper-resolución no solo reduce el coste general y la complejidad del sistema, sino que también evita problemas relacionados con aberración cromática, que otras implementaciones de microscopía de súper-resolución necesitan compensar.

Suministro de herramientas estándar para estudios de colocalización en la escala nanométrica

Leica Microsystems ha implementado 2C STED basándose en la ‘perspectiva de rosca’. Ambos sistemas de súper-resolución confocal, el Leica TCS STED y el Leica TCS STED CW, se han equipado para realizar estudios de colocalización en el ámbito de menos de 100 nm. Con este fin, se introdujo un segundo láser de excitación a 531 nm además de la línea de 640 nm para el Leica TCS STED, que materializa la nanoscopia confocal con láseres de impulsos en la gama de rojo profundo. Además, se ha diseñado un cubo de filtros especial para los detectores de fotodiodos de avalancha (APD) de alta sensibilidad para la pareja de tintes recomendados Chromeo 494/Atto 647N. De esta forma se garantiza una separación optima de los tintes sin necesidad de postprocesamiento (Fig. 1 y 2).

El Leica TCS STED CW utiliza láseres de onda continua para la obtención de imágenes STED en el rango visible. Facilita la nanoscopia confocal con tintes estándar verdes, p. ej. Alexa 488, Oregon Green 488, FITC, Chromeo 488, y también con proteínas autofluorescentes (FP), p. ej. eYFP, Citrina y Venus. Un objetivo de diseño reciente, el HCX PL APO 100x 1,40NA Oil STED Orange, permite al usuario del TCS STED CW elegir libremente cualquier línea de argón (458, 476, 488, 496, 514 nm) para la excitación junto con el láser de 592 nm para STED. Así, numerosas combinaciones de tintes y proteínas fluorescentes se han empezado a aplicar a la nanoscopia confocal 2C.

Se obtienen imágenes 2C excelentes, por ejemplo, de muestras teñidas con BD Horizon V500 y Oregon Green 488 sin interferencia entre canales. Las combinaciones de fluoróforos que presentan un solapamiento espectral mayor también han producido buenos resultados tras la separación de tintes con el paquete de software adecuado en el software Leica LAS AF. Debido a la multitud de tintes y FP disponibles, especialmente en el rango visible, cada vez habrá más combinaciones de fluoróforos que resultarán útiles para la nanoscopia confocal multicolor.

Conclusiones

La capacidad de seccionado óptico de la microscopía confocal ha impulsado los estudios de colocalización hasta el siguiente nivel. Aún así, la resolución limitada por difracción a menudo enmascara importantes detalles subcelulares en las pilas z registradas. Mediante su inclusión completa en instrumentos confocales de vanguardia, la microscopía STED multicolor permite un acceso rápido, objetivo y sencillo a morfologías ocultas en cortes ópticos de células, tejidos e incluso organismos.

Los sistemas de nanoscopia confocal multicolor Leica TCS STED y Leica TCS STED CW permiten a los investigadores de ciencias de la vida explorar la arquitectura celular más allá del límite de difracción.

Referencias

1. Hell S.W. and Wichmann J.: Opt. Lett. 19, 780–782 (1994)
2. Donnert G., et al.: Biophys J. 92(8):L67-9 (2007)
3. Schmidt R, et al.: Nat. Methods 5(6):539-44 (2008)

Este artículo fue publicado en:
G.I.T. Imaging & Microscopy 4/2010, GIT VERLAG GmbH & Co KG
Contacto: Dr. Martin Friedrich, martin.friedrich@wiley.com
www.imaging-git.com

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